Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
O ρόλος της τελομεράσης στην παθογένεια της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης. Ένας σύνδεσμος της επιθηλιακή απόπτωσης και διαφοροποίησης
Πνεύμων 2010, 23(3):207-223
ΠΕΡIΛΗΨΗ.

Εισαγωγή:
Εκτενείς μελέτες έχουν υπογραμμίσει τον κεντρικό ρόλο της τελομεράσης για την μακροβιότητα των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση και την έχουν συνδέσει με την κυτταρική αθανασία. Επομένως, μπορεί να είναι καθοριστικής σημασίας για την παθογένεια της ινωτικής εξεργασίας του πνεύμονα. Σκοπός της μελέτης μας ήταν να εμπλέξουμε την τελομεράση στην παθογένεια της ιδιοπαθούς διάμεσης πνευμονοπάθειας. Ασθενείς και μέθοδοι: Ο ρόλος της τελομεράσης διερευνήθηκε με μια σειρά ανοσοϊστοχημικών μελετών και φθορίζοντα in situ υβριδισμού (FISH) σε ιστικές μικροσυστοιχίες (tissue microarrays-TMAs) από αντιπροσωπευτικά ιστικά δείγματα ασθενών με δυο διαφορετικές μορφές πνευμονικής ίνωσης, της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (IPF) και της κρυπτογενούς οργανοποιού πνευμονίας (COP), καθώς και ασθενών της ομάδας ελέγχου. Αποτελέσματα: Παρατηρήσαμε σημαντική ελάττωση στην έκφραση της τελομεράσης τόσο σε πρωτεϊνικό επίπεδο όσο και σε mRNA στους ασθενείς με πνευμονική ίνωση συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Τόσο οι ανοσοϊστοχημικές μελέτες όσο και η FISH ανάλυση αποκάλυψαν δύο υποπληθυσμούς τύπου ΙΙ πνευμονοκυττάρων με βάση τα επίπεδα έκφρασης της τελομεράσης: τα τελομεράση θετικά τύπου II πνευμονοκύτταρα, περιβάλλοντα περιοχές ενεργού ίνωσης και επιδεικνύοντας αυξημένα επίπεδα έκφρασης δεικτών διαφοροποίησης και τα τελομεράση αρνητικά κύτταρα κυρίως εντοπιζόμενα σε περιοχές εγκατεστημένης ίνωσης τα οποία χαρακτηρίζονταν από υψηλά επίπεδα απόπτωσης. Συμπεράσματα: Η ελαττωμένη έκφραση της τελομεράσης στην IPF δύναται να αναδεικνύει μια αιτιολογική συσχέτιση μεταξύ χαμηλής έκφρασης τελομεράσης και παθογένειας της ίνωσης. Η διφορούμενη έκφραση της τελομεράσης στα προγονικά επιθηλιακά πνευμονοκύτταρα δείχνει ότι η τελομεράση ρυθμίζει τη μοίρα των κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων είτε προς έναν αποπτωτικό ή προς έναν μεσεγχυματικό φαινότυπο συνεισφέροντας έτσι στην ινωτική εξεργασία. Πνεύμων 2010, 23(3):207-223.

ΕΙΣΑΓΩΓH

Η τελομεράση είναι μια εκλεκτική ανάστροφη μεταγραφάση η οποία καταλύει την προσθήκη εξαμερών TTAGGG τελομερών DNA στις άκρες των χρωμοσωμάτων, αντιρροπώντας έτσι στη διάβρωση των τελομερών που φυσιολογικά συμβαίνει μετά από κάθε κυτταρική διαίρεση και συνεισφέροντας στη σταθερότητα, τη λειτουργία και τον διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων1,2. Αποτελείται από δυο βασικές υπομονάδες: την καταλυτική, ανάστροφη μεταγραφάση της τελομεράσης (h-TERT) και την RNA (hTR)3 που λειτουργεί ως υπόστρωμα της καταλυτικής. Εκτενείς αναφορές έχουν δείξει ότι η τελομεράση κατέχει κεντρικό ρόλο στην κυτταρική μακροβιότητα, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση ενώ έχει συνδεθεί και με την κυτταρική αθανασία4. Επιπρόσθετα, μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση ή η δραστηριότητα του ενζύμου δεν περιορίζεται μόνο σε καρκινικά ή μεταλλαγμένα κύτταρα αλλά σχετίζεται και με την ιστική βλάβη5. Παρά την πληθώρα όμως των δεδομένων σχετικά με την επαγωγή της δραστηριότητας της τελομεράσης και σε μη καρκινωματώδεις κυτταρικές σειρές6,7 και τη συσχέτιση της με την ιστική βλάβη8 και φλεγμονή9, ο ρόλος της στις μη καρκινωματώδεις εξεργασίες που χαρακτηρίζονται από αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και κύτταρα ανθεκτικά στην απόπτωση, παραμένει εν πολλοίς άγνωστος και ασαφής. Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (IPF) αποτελεί μια τέτοια διεργασία που χαρακτηρίζεται από αυξημένη επιθηλιακή απόπτωση, συναθροίσεις γρήγορα πολλαπλασιαζόμενων «αθάνατων» ινοβλαστών που καλούνται ινοβλαστικές εστίες (fibroblastic foci-FF) και συνθέτουν το παθολογοανατομικό πρότυπο της συνήθους διάμεσης πνευμονίας (usual interstitial pneumonia-UIP)10.

Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η ενεργός ίνωση στην IPF αντανακλά την παθολογική ανταπόκριση του επιθηλίου σε συνεχή βλαπτικά ερεθίσματα ενώ έχουν επίσης αναφερθεί παραλληλισμοί μεταξύ της καρκινογένεσης και της ινογένεσης10-12. Αντίθετα με την IPF η οποία χαρακτηρίζεται από καταστροφή του πνευμονικού παρεγχύματος και μη αναστρέψιμη ίνωση, άλλες μορφές πνευμονικής ίνωσης όπως η κρυπτογενής οργανοποιός πνευμονία (COP) που χαρακτηρίζεται από ινομυξωματώδεις βλάβες που λέγονται σωμάτια Masson (MB) εμφανίζονται με ευνοϊκή πρόγνωση και κλινική πορεία13,14.

Πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει αυξημένη δραστηριότητα τελομεράσης σε ινοβλάστες απομονωθέντες από πνεύμονες ποντικιών μετά την έγχυση μπλεομυκίνης15-17. Η τελευταία παρατήρηση ενισχύθηκε και από το εύρημα ότι η απώλεια της δραστηριότητας της τελομεράσης είναι στενά συσχετιζόμενη με τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών σε μυοϊνοβλάστες και πιθανόν να δρα σαν πυροδοτικός παράγοντας αυτής της διαδικασίας18,19. Επιπλέον έχει αναφερθεί ότι η απώλεια έκφρασης της τελομεράσης οδηγεί σε απόπτωση των επιθηλιακών κυττάρων ποντικιών μετά από έγχυση μπλεομυκίνης20, ενώ παράλληλα έχει περιγραφεί και η αιτιολογική συσχέτιση της έλλειψης τελομεράσης στους ινοβλάστες ποντικών με την επαγόμενη από μπλεομυκίνη πνευμονική ίνωση21. Ωστόσο, η ανθρώπινη τελομεράση διαφέρει πάρα πολύ από αυτήν του ποντικού τόσο στη λειτουργία όσο και στη ρύθμιση ενώ το πειραματικό μοντέλο της μπλεομυκίνης δεν είναι πλήρως αντιπροσωπευτικό της IPF21.

Για τους παραπάνω λοιπόν λόγους χρειάζεται μια ανθρώπινη μελέτη. Δυο πρόσφατα δημοσιευμένες μελέτες σε ασθενείς με οικογενή IPF15,22 περιγράφουν έναν πρωτογενή ρόλο για τις μεταλλαγές στις υπομονάδες της τελομεράσης στην παθογένεια της IPF, προτείνοντας ότι η παρουσία βραχέων τελομερών στα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα μπορεί να οδηγήσει στην απόπτωση τους και να πυροδοτήσει την ινωτική εξεργασία μέσω επιθηλιακών-μεσεγχυματικών αλληλεπιδράσεων. Παρά το γεγονός ότι η οικογενής IPF δεν διαφοροποιείται κλινικά από την σποραδική μορφή πλην της νεότερης ηλικίας έναρξης της νόσου (55 έτη vs. 67 έτη)23, ωστόσο δεν υπάρχουν βιβλιογραφικές αναφορές που να συσχετίζουν την έκφραση και την κυτταρική εντόπιση του ενζύμου σε δείγματα πνεύμονα ασθενών με διαφορετικές μορφές πνευμονικής ίνωσης. Για να απαντήσουμε σε αυτό το ερώτημα, κατασκευάσαμε ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs) και δείξαμε ελαττωμένη έκφραση της τελομεράσης σε αντιπροσωπευτικά ιστικά δείγματα ασθενών με σποραδική IPF και COP συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου συσχετίζοντας έτσι την υποέκφραση του ενζύμου με την παθογένεια της ίνωσης. Το πιο σημαντικό όμως εύρημα της μελέτης μας ήταν ότι δείξαμε για πρώτη φορά την παρουσία δυο υποπληθυσμών τύπου II πνευμονοκυττάρων με βάση τα επίπεδα έκφρασης της τελομεράσης: τα τελομεράση θετικά τύπου II πνευμονοκύτταρα, περιβάλλοντα περιοχές ενεργού ίνωσης και επιδεικνύοντας αυξημένα επίπεδα έκφρασης δεικτών διαφοροποίησης και τα τελομεράση αρνητικά κύτταρα κυρίως εντοπιζόμενα σε περιοχές εγκατεστημένης ίνωσης τα οποία χαρακτηρίζονταν από υψηλά επίπεδα απόπτωσης. Μερικά από τα δεδομένα που αναφέρονται εδώ έχουν δημοσιευθεί με τη μορφή περίληψης στα πεπραγμένα ιατρικών συνεδρίων24,25.

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ


Ασθενείς

Συνολικά, 45 πρωτοδιαγνωσμένοι ασθενείς με ιδιοπαθή διάμεση πνευμονία (IIPs) δυο διαφορετικών παθολογοανατομικών προτύπων μεταξύ των οποίων 25 ασθενών με IPF/UIP και 20 με COP συμπεριλήφθησαν στη μελέτη μας. Η διάγνωση τέθηκε με βάση τη θέση ομοφωνίας της ATS/ERS (2002)26. Ιστικά δείγματα ελήφθησαν με ανοιχτή βιοψία ή video assisted thoracoscopic surgery-VATS από δυο διαφορετικές περιοχές κάθε ασθενούς και μονιμοποιήθηκαν σε παραφφίνη. Όλοι οι ασθενείς ήταν πλήρως ενημερωμένοι και υπέγραψαν έντυπο συγκατάθεσης με ο οποίο συμφωνούσαν στην ανώνυμη χρήση των δειγμάτων πνεύμονα για ερευνητικούς σκοπούς. Επιπλέον η μελέτη μας έτυχε της έγκρισης από την τοπική επιστημονική επιτροπή (Αριθμός πρωτοκόλλου: 1669). Είκοσι μπλόκ παραφφίνης συλλέχθησαν από τα αρχεία τριων παθογοανατομικών τμημάτων (Πίνακας 1).

Ποσοτική αντίδραση ανάστροφης μεταγραφάσης πραγματικού χρόνου (quantitative Real-Time reverse transcriptase-chain reaction- qRT-PCR)

H έκφραση του mRNA της h-TERT υπομονάδας εκτιμήθηκε ποσοτικά στους ασθενείς με IPF και στην ομάδα ελέγχου με τη χρήση qRT-PCR μεθόδου με SYBR-Green I QPCR Master Mix. Οι αλληλουχίες των εκκινητών ήταν οι ακόλουθες: για την h-TERT; Για 5’- TGA CAC CTC ACC TCA CCC AC-3’ και hTERT REV: 5’- CAC TGT CTT CCG CAA GTT CAC -3’ και για την GAPDH; για: 5’- GGA AGG TGA AGG TCG GAG TCA-3’ και GAPDH REV: 5’-GTC ATT GAT GGC AAC AAT ATC CAC T-3’.

Ενεργότητα της τελομεράσης

Η ενεργότατα της τελομεράσης εκτιμήθηκε σε 15 συνολικά δείγματα πνευμόνων (8 με IPF και 7 φυσιολογικών), χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο ανάλυσης TRAP (telomeric repeat amplification protocol) σε συμφωνία με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA plus detection kit; Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)27. Εν συντομία, 10 μg απομονωμένου ιστού τοποθετήθηκαν σε 30 μl μείγματος αντιδραστηρίου (που περιελάμβανε υπόστρωμα τελομεράσης συνδυασμένο με βιοτινικά κατάλοιπα, βελτιστοποιημένο εκκινητή, νουκλεοτίδια, Taq πολυμεράση, και μια 216-bp καθορισμένη εσωτερική αλληλουχία DNA). Στο τελικό μείγμα διενεργήθηκε PCR. Η ενεργότητα της τελομεράσης ποσοτικοποιήθηκε μετρώντας την απορρόφηση των παραγώγων της PCR στα 450 nm. Τα επίπεδα ενεργότητας της τελομεράσης σε δεδομένο δείγμα καθορίστηκαν συγκρίνοντας το σήμα του δείγματος που θέλαμε να υπολογίσουμε, με το παρατηρούμενο σήμα δείγματος γνωστής ποσότητας του επιστρώματος ελέγχου. Βασισμένοι στα αρνητικά δείγματα ελέγχου, δείγματα με απορρόφηση λιγότερο από 0,2 θεωρήθηκαν αρνητικά.

Κατασκευή της ιστικής μικροσυστοιχίας (TMA)

Για την κατασκευή της ΤΜΑ χρησιμοποιήθηκαν 65 συνολικά ιστικά δείγματα από 25 IPF, 20 COP και 20 ασθενείς της ομάδας ελέγχου προερχόμενα από άτομα που υπεβλήθησαν σε χειρουργική επέμβαση για την αφαίρεση καλοήθης βλάβης του πνεύμονα. Τρεις αντιπροσωπευτικές περιοχές διαμέτρου 1.5 mm η κάθεμια εκφυτεύτηκαν από τους κύβους παραφίνης και επανεμφυτεύτηκαν με τη χρήση ειδικού οργάνου (TMA-100, Chemicon, USA) σε νέο κύβο παραφφίνης κάτω από αυστηρές συντεταγμένες όπως έχει περιγραφεί σε άλλη μελέτη28. Τελικά κατασκευάσαμε 2 TMA μπλοκ αποτελούμενα από 100 ιστικούς πυρήνες το καθένα.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Η ανοσοϊστοχημεία για το αντιγόνο της h-TERT πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ειδικού μονοκλωνικού αντισώματος (anti-h-TERT mouse monoclonal antibody- clone 44F12-Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle United Kingdom). Για την περαιτέρω ανάλυση της κυτταρικής εντόπισης της τελομεράσης στα τύπου Ι ή ΙΙ πνευμονοκύτταρα και στους μυοϊνοβλάστες ή στους ινοβλάστες πραγματοποιήσαμε διπλή ανοσοϊστοχημική χρώση για την h-TERT και τον surfactant-SP-A ή για την h-TERT και την a-smooth muscle actin (a-SMA), αντίστοιχα. Για να εκτιμήσουμε τη διαφοροποίηση των AECs στον ΙPF και COP πνεύμονα τα ιστικά δείγματα βάφτηκαν με ειδικό αντίσωμα έναντι της N-καντχερίνης (rabbit polyclonal antibody, GeneTex, GTX12221). Για την εκτίμηση της πολλαπλασιαστικής ικανότητας των ινοβλαστικών εστιών πραγματοποιήσαμε διπλή ανοσοϊστοχημική χρώση για τον παράγοντα ki-67 (ab8191, Abcam Limited Co) και για τον a-SMA όπως και προηγουμένως.

Προσδιορισμός της απόπτωσης

Η αποπτωτική δραστηριότητα εκτιμήθηκε με τη χρήση ειδικού αντισώματος έναντι του παράγοντα κατακερματισμού του DNA [DNA fragmentation factor (DFF)]29 (Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle United Kingdom).

Φθορίζων in situ υβριδισμός (FISH) για προσδιορισμό της hTR υπομονάδας

Η εκτίμηση της έκφραση της hTR υπομονάδας έγινε με τη χρήση FISH. Ηανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ειδικού hTR probe το οποίο υβριδίζει σε περιοχές εντός των 451 βάσεων της hTR υπομονάδας (DakoCytomation, Y1441). Τα επίπεδα του mRNA εκτιμήθηκαν αυτόματα με τη χρήση του υψηλής ευκρίνειας μικροσκοπίου DUET, BioView σύστημα σάρωσης για FISH, μορφολογία ανοσοϊστοχημικές εφαρμογές. Λάβαμε ως «αυξημένη έκφραση» την παρουσία >10 αντιγράφων mRNA ανά κύτταρο, ως «χαμηλή έκφραση» την παρουσία 6-10 αντιγράφων mRNA ανά κύτταρο και ως «καθόλου έκφραση» την παρουσία <6 αντιγράφων mRNA ανά κύτταρο.

Εκτίμηση των αποτελεσμάτων της ανοσοϊστοχημείας με σύστημα υπολογιστικής ανάλυσης εικόνας (Computerized Image Analysis)

Προκειμένου να εκτιμήσουμε τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας όχι ποιοτικά αλλά ποσοτικά και με ακρίβεια χρησιμοποιήσαμε ένα ημι-αυτόματο σύστημα υπολογιστικής ανάλυσης εικόνας (Matrox II Card Frame Grabber, Camera Microwave Systems, Μicroscope Olympus BX-50) το οποίο μας επέτρεψε να εκτιμήσουμε την χρωματική ένταση του σήματος σε μια κλίμακα 256-επιπέδων 0 (μαύρο)-255 (άσπρο). Στη συνέχεια οι τιμές της χρωματικής έντασης μετατράπηκαν σε ανάστροφα % ποσοστά.

ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ


Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος SPSS 13.0 software. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές mean + SD, εκτός και αν υποδεικνύονταν διαφορετικά. Το unpaired t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνουμε τη χρωματική ένταση των διαφορετικών υπό μελέτη παραγόντων μεταξύ των ασθενών με πνευμονική ίνωση και των ατόμων της ομάδας ελέγχου. Το paired t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνουμε τη χρωματική ένταση στα επιθηλιακά κύτταρα, του ινοβλάστες και τους μυοϊνοβλάστες των ασθενών με IPF/UIP, COP και των ατόμων της ομάδας ελέγχου. Τιμή p <0.05 λήφθηκε ως στατιστικά σημαντική.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ


Ελαττωμένη έκφραση τελομεράσης στους ινωτικούς πνεύμονες συγκριτικά με τον φυσιολογικό πνεύμονα

Επειδή δεν υπήρχε καμιά διαθέσιμη πληροφορία στη βιβλιογραφία σχετικά με την έκφραση της τελομεράσης σε ασθενείς με πνευμονική ίνωση υπολογίσαμε την έκφραση της τελομεράσης τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και πρωτεΐνης με τη χρήση qRT-PCR, FISH και ανοσοϊστοχημικής ανάλυσης αντίστοιχα, σε ασθενείς με IPF, COP και σε ιστικά δείγματα της ομάδας ελέγχου.

Για να επισπεύσουμε και να στανταροποιήσουμε τις πειραματικές διαδικασίες κατασκευάσαμε δυο ιστικές μικροσυστοιχίες αποτελούμενες από 100 ιστικούς πυρήνες από 25 IPF, 20 COP και 20 ιστικά δείγματα της ομάδας ελέγχου. Οι ιστικές μικροσυστοιχίες βάφτηκαν με ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της h-TERT υπομονάδας και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν ποσοτικά με τη χρήση ειδικού προγράμματος υπολογιστικής ανάλυσης εικόνας, όπως περιγράφτηκε παραπάνω. Όπως αναμενόταν, η qRT-PCR αποκάλυψε σημαντικά ελαττωμένη έκφραση της τελομεράσης στα δείγματα πνεύμονα ασθενών με IPF συγκριτικά με τα δείγματα φυσιολογικού πνεύμονα (p<0.0001) αναδεικνύοντας έτσι μια αιτιολογική σχέση μεταξύ της μειωμένης έκφρασης του ενζύμου και της πνευμονικής ίνωσης (Εικόνα 1). Επιπλέον, η ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ελαττωμένη έκφραση τελομεράσης στους ινωτικούς πνεύμονες των ασθενών με IPF (p<0.001) και COP (p<0.001), συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, εντοπιζόμενη κυρίως στο κυψελιδικό επιθήλιο (Εικόνα 2).



Υπερέκφραση τελομεράσης στα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα περιβάλλοντα περιοχές ινοβλαστικής δραστηριότητας στον IPF πνεύμονα Προκειμένου να αναλύσουμε περαιτέρω την κυτταρική εντόπιση της έκφρασης της τελομεράσης πραγματοποιήσαμε διπλή ανοσοϊστοχημική μελέτη και δείξαμε ότι η ελαττωμένη έκφραση της τελομεράσης εντοπιζόταν κυρίως στα τύπου ΙΙ κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα [τελομεράση (-) κύτταρα] τα οποία εντοπιζόταν κυρίως σε περιοχές καταστροφής του αρχιτεκτονικού παρεγχύματος και εγκατεστημένης ίνωσης (περιοχές με εικόνα δίκην μελισσοκηρύθρας) στον IPF πνεύμονα (p<0.001) (Εικόνα 3A-C). Αντίθετα παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση του ενζύμου στα πνευμονοκύτταρα τύπου ΙΙ τα οποία περιέβαλλαν περιοχές επιθηλίου που τουλάχιστον μακροσκοπικά φαίνονταν φυσιολογικές, εντός του IPF πνεύμονα (Εικόνα 3G-H). Επιπρόσθετα στους ασθενείς με COP η πλειοψηφία των τύπου ΙΙ πνευμονοκυττάρων των άμεσα γειτνιάζοντων με περιοχές οργανούμενης πνευμονία επιδείκνυαν ελαττωμένα επίπεδα έκφρασης (Εικόνα 3D-F). Το πιο όμως εντυπωσιακό εύρημα της μελέτης μας ήταν η αναγνώριση πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ με διαφορετική μορφολογία από ότι τα φυσιολογικά, δηλαδή επιπεδωμένων, μακρόστενων κυττάρων τα οποία περιέβαλλαν περιοχές ενεργού ίνωσης κυρίως στον IPF πνεύμονα (p<0.001) και σε λιγότερο βαθμό στον COP (p<0.02) πνεύμονα και χαρακτηρίζονταν από αυξημένα επίπεδα έκφρασης τελομεράσης [τελομεράση (+) κύτταρα]. Το παραπάνω εύρημα μπορεί να σημαίνει ότι τα κύτταρα αυτά λόγω της αυξημένης έκφρασης τελομεράσης να είναι ανθεκτικά στην απόπτωση και να χαρακτηρίζονται από υψηλή διαφοροποιητική και πολλαπλασιαστική ικανότητα. (Εικόνα 4). Σε συνάρτηση με τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας η ανάλυση με FISH έδειξε περιοχές αυξημένης ενίσχυσης σήματος όχι μόνο στο επιθήλιο του φυσιολογικού πνεύμονα αλλά και σε περιοχές υπερπλαστικού επιθηλίου άμεσα γετνιάζουσες με ινοβλαστικές εστίες εντός του IPF πνεύμονα στις 19 από τις 25 περιπτώσεις και περιοχές χαμηλής ενίσχυσης σήματος στους 15 από τους 20 ασθενείς με COP (Εικόνα 5).




Αυξημένη έκφραση τελομεράσης στις εστίες ινοβλαστών/μυοϊνοβλαστών στον IPF σε σύγκριση με τον COP πνεύμονα

Προκειμένου να αναγνωρίσουμε διακριτά εκφραστικά πρότυπα τελομεράσης μεταξύ των ινοβλαστικών εστιών στις δυο διαφορετικές μορφές πνευμονικής ίνωσης, πραγματοποιήσαμε διπλή ανοσοϊστοχημική χρώση και δείξαμε επαγωγή στην έκφραση του ενζύμου στις ινοβλαστικές/μυοϊνοβλαστικές εστίες στους IPF ασθενείς (Εικόνα 6A-B) σε σύγκριση με τα σωμάτια Masson που χαρακτηρίζουν το παθολογοανατομικό πρότυπο της οργανούμενης πνευμονίας (Εικόνα 6D-F) (p<0.001). Το προηγούμενο εύρημα ενισχύθηκε ακόμα περισσότερο με την FISH ανάλυση που αποκάλυψε περιοχές ενισχυμένου σήματος εντός του ινωτικού διάμεσου χώρου στον IPF πνεύμονα (17 από τις 25 περιπτώσεις) (Εικόνα 5D) συγκριτικά με τον COP πνεύμονα όπου ανιχνεύσαμε ινωτικές περιοχές χαμηλής ενίσχυσης σήματος στους 18 από τους 20 συνολικά ασθενείς (Εικόνα 5F). Τα αποτελέσματα αυτά μας παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης και μπορούν να εξηγήσουν τις σημαντικές διαφορές τις οποίες εμφανίζουν οι δυο αυτές μορφές ιδιοπαθούς διάμεσης πνευμονίας όσον αφορά την προοδευτικότητα της νόσου και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Επίσης δύναται να απαντήσουν στο ερώτημα γιατί οι βλάβες της COP υπόκεινται πλήρη ίαση μετά τη χορήγηση κορτικοειδών σε αντίθεση με τις ινοβλαστικές εστίες της IPF που είναι ανθεκτικές στην απόπτωση και εξελίσσονται ταχύτατα παρά τη θεραπευτική αγωγή.



Παρόμοια με την τελομεράση εκφραστικά πρότυπα απόπτωσης, διαφοροποίησης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού στους ινωτικούς πνεύμονες

Για να επιβεβαιώσουμε αν το προφίλ έκφρασης της τελομεράσης συνοδεύεται από παρόμοιο εκφραστικό πρότυπο απόπτωσης εκτιμήσαμε την έκφραση του επαγόμενου από την κασπάση παράγοντα κατακερματισμού του DNA [DNA fragmentation factor-DFF]. Σε συνάρτηση με το εκφραστικό πρότυπο της τελομεράσης παρατηρήσαμε αυξημένη απόπτωση στο κυψελιδικό επιθήλιο τόσο του IPF (p<0.001) όσο και του COP πνεύμονα (p<0.02) σε σύγκριση με το φυσιολογικό πνευμονικό ιστό (Εικόνα 7A-C). Επιπλέον, παρατηρήσαμε αυξημένη αποπτωτική δραστηριότητα στο κυψελιδικό επιθήλιο που περιέβαλλε περιοχές κατεστραμμένου πνεύμονα και εγκατεστημένης ίνωσης (περιοχές δίκην μελικηρύθρα), όπου κυριαρχούσαν τα τελομεράση (-) επιθηλιακά κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα αυτά ήταν πιο πιθανό να υφίστανται απόπτωση λόγω της απουσίας έκφρασης της τελομεράσης. Περαιτέρω, αυξημένη απόπτωση σημειώθηκε και στις περιοχές ινοβλαστικής δραστηριότητας του COP πνεύμονα σε αντίθεση με τις αντίστοιχες του IPF όπου η απόπτωση ήταν ελάχιστη. Η παρατήρηση αυτή ενισχύει ακόμα περισσότερο τον ρόλο της τελομεράσης στο παράδοξο φαινόμενο της απόπτωσης που χαρακτηρίζει την IPF: προδιάθεση για απόπτωση από τα επιθηλιακά κύτταρα και ανθεκτικότητα στην απόπτωση από τους ινοβλάστες (Εικόνα 7A-D).



Τέλος, λόγω της έλλειψης δεδομένων που να υποστηρίζουν εμπλοκή της τελομεράσης στην κυτταρική διαφοροποίηση εκτιμήσαμε το εκφραστικό πρότυπο ενός δείκτη μεσεγχυματικής διαφοροποίησης, της Ν-καντ¬χερίνης και παρατηρήσαμε ότι αλληλεπικαλυπτόταν με αυτό της τελομεράσης. Πιο συγκεκριμένα παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση στα υπερπλαστικά, μορφολογικά διαφοροποιημένα επιθηλιακά κύτταρα (με φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν των μεσεγχυματικών κυττάρων) (p<0.01) που περιέβαλλαν ινοβλαστικές εστίες και στα δυο πρότυπα πνευμονικής ίνωσης τονίζοντας ότι τα κύτταρα αυτά χρειάζονται αυξημένα επίπεδα τελομεράσης όχι μόνο για να είναι ανθεκτικά στην απόπτωση αλλά επιπλέον για να υφίστανται ένα είδος μεταπλασίας, την επιθηλιακή – μεσεγχυματική μετάπτωση (Εικόνα 7E-H).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ


Με βάση την τρέχουσα βιβλιογραφία η μελέτη μας αποτελεί την πρώτη αναφορά σχετικά με την έκφραση της τελομεράσης σε ασθενείς με ιδιοπαθή διάμεση πνευμονοπάθεια και τα ευρήματα αυτής υποστηρίζουν μια αιτιολογική συσχέτιση μεταξύ χαμηλής έκφρασης τελομεράσης και παθογένειας πνευμονικής ίνωσης, όπως ακριβώς έχει αποδειχθεί με τη συγγενή δυσκεράτωση (dyskeratosis congenital)30,31, ένα σπάνιο σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από μεταλλαγές στο ενζυμικό σύμπλεγμα της τελομεράσης και πνευμονική ίνωση προσομοιάζουσα της IPF. O σχεδιασμός της μελέτης μας είχε ως εξής: Χρησιμοποιήσαμε qRT-PCR πραγματικού χρόνου και δείξαμε ελαττωμένη έκφραση τελομεράσης στους ασθενείς με IPF συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Επιπρόσθετα, κατασκευάσαμε δυο ιστικές μικροσυστοιχίες αποτελούμενες από 100 αντιπροσωπευτικά ιστικά δείγματα από ασθενείς με IPF και COP και από φυσιολογικό πνευμονικό ιστό της ομάδας ελέγχου. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση σε συνδυασμό με τη υπολογιστική ανάλυση της εικόνας αποκάλυψαν ελαττωμένη έκφραση του ενζύμου στους ινωτικούς πνεύμονες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Στη συνέχεια επιλέξαμε να αναλύσουμε την κυτταρική εντόπιση της έκφρασης της τελομεράσης τόσο με διπλή ανοσοϊστοχημεία όσο και με FISH και δείξαμε μειωμένη έκφραση τελομεράσης στα πνευμονοκύτταρα τύπου II που περιέβαλλαν περιοχές κατεστραμμένου πνεύμονα και εγκατεστημένης ίνωσης εντός του IPF πνεύμονα. Ένα από τα πιο ενδιαφέροντα σημεία της μελέτης μας ήταν η ανίχνευση αυξημένων επιπέδων έκφρασης τελομεράσης όχι μόνο στο φυσιολογικό επιθήλιο του IPF πνεύμονα αλλά και στα αναγεννητικά μορφολογικά μεταλλαγμένα τύπου ΙΙ πνευμονοκύτταρα που γειτνίαζαν με περιοχές ενεργού ίνωσης, κυρίως στον IPF πνεύμονα και σε μικρότερο βαθμό στα COP ιστικά δείγματα. Ακόμα πιο εντυπωσιακά, η τοπική ετερογένεια στην έκφραση της τελομεράσης συνοδεύτηκε και από παρόμοια εκφραστικά πρότυπα δεικτών απόπτωσης, διαφοροποίησης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού, όπως ακριβώς εκτιμήθηκαν με ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις.

Στην IPF/UIP, συναθροίσεις ινοβλαστών και μυοϊνοβλαστών εντοπιζόμενες κυρίως στις υποϋπεζωκοτικές ζώνες του διάμεσου χώρου αποτελούν το παθογενετικό ορόσημο και ένα από τα κριτήρια για την διάγνωση της νόσου10. Η εμμένουσα παραμονή των εστιών αυτών παρά τη λήψη θεραπείας όπως εκτιμάται από την μακροβιότητα και τον αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων αυτών ίσως να αποτελεί τη βάση για την προοδευτική εξέλιξη και επιδείνωση της ινωτικής εξεργασίας. Ενώ όμως η κλινική πορεία των ασθενών με IPF είναι δυσμενής, εντούτοις ασθενείς πάσχοντες από άλλους τύπους πνευμονικής ίνωσης παρουσιάζονται με εξαιρετική πρόγνωση και άριστη ανταπόκριση στη θεραπεία με κορτικοειδή19. Εκτενείς μελέτες έχουν αποδώσει αυτές τις διαφορές στα διακριτά παθογενετικά πρότυπα που χαρακτηρίζουν τα δυο αυτά νοσήματα και τα οποία αντανακλώνται στα διαφορετικά αποπτωτικά32-34 και αγγειογενετικά πρότυπα έκφρασης35-37. Επιπρόσθετα, ενώ το κυψελιδικό επιθήλιο θεωρούνταν επί δεκαετίες ως παθητικός παρατηρητής κατά τη διαδικασία της ινογένεσης, τα τελευταία χρόνια η άποψη ότι τα επαναλαμβανόμενα βλαπτικά ερεθίσματα επάγουν πλην της απόπτωσης και τη διαφοροποίηση των αναγεννητικών πνευμονοκυττάρων τύπου II με μια διαδικασία που λέγεται επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάπτωση (epithelial-mesenchymal transition-EMT) έχει συγκεντρώσει μεγάλο επιστημονικό ενδιαφέρον38-40.

Πρόσφατες μελέτες που επικέντρωσαν στην έκφραση της τελομεράσης σε ινοβλάστες απομονωθέντες από το πειραματικό μοντέλο της μπλεομυκίνης αποκάλυψαν ένα σημαντικό ρόλο της τελομεράσης στην κυτταρική διαφοροποίηση. Πιο συγκεκριμένα, ο Phan και οι συνεργάτες του πρότειναν ότι η επαγωγή της δραστηριότητας της τελομεράσης σε ινοβλάστες αρουραίου μπορεί να οφείλεται σε μεσολαβητές του πολλαπλασιασμού των ινοβλαστών ενώ αντίθετα η απώλεια έκφρασης του ενζύμου από ειδικούς αναστολείς πυροδοτεί τη διαφοροποίηση τους σε μυοϊνοβλάστες15,21-23. Επιπλέον, ο Fridlender και οι συνεργάτες του ενέπλεξαν την χαμηλή δραστηριότητα του ενζύμου στην εκσεσημασμένη απόπτωση των κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων ποντικού μετά από έγχυση μπλεομυκίνης τονίζοντας περαιτέρω ότι η βαθμιαία αύξηση της δραστηριότητας της τελομεράσης στα επιθηλιακά κύτταρα ίσως και να αντιπροσωπεύει έναν αμυντικό μηχανισμό ενάντια στις άμεσα προσκείμενες ινοβλαστικές εστίες που επάγουν την απόπτωση κατά την ινωτική εξεργασία24. Ωστόσο, η ανθρώπινη τελομεράση διαφέρει σημαντικά από εκείνη του ποντικού τόσο στις λειτουργικές όσο και στις ρυθμιστικές ιδιότητες ενώ και το πειραματικό μοντέλο της ίνωσης με μπλεομυκίνη δεν είναι πλήρως αντιπροσωπευτικό της IPF λόγω της αυτοϊώμενης φύσης του, της ταχύτητας ανάπτυξης του και της στενής σχέσης της φλεγμονής με την πνευμονική ίνωση21. Επιπρόσθετα, στο επίπεδο της ανθρώπινης νόσου είναι εν πολλοίς άγνωστη η σχέση μεταξύ της δράσης ή αναστολής της τελομεράσης και της ανάπτυξης και προοδευτικής εξέλιξης της πνευμονική ίνωσης23.

Επομένως κρίνεται απαραίτητη η διενέργεια μιας ανθρώπινης μελέτης. Για το λόγο αυτό μελετήσαμε για πρώτη φορά στην τρέχουσα βιβλιογραφία, την έκφραση της τελομεράσης σε ιστικά δείγματα ασθενών με δυο διαφορετικές μορφές πνευμονικής ίνωσης, IPF και COP. Χρησιμοποιήσαμε την πρωτοποριακή τεχνολογία των ιστικών μικροσυστοιχιών η οποία μας επέτρεψε την ταυτόχρονη ανάλυση έως και 200 ιστικών κύβων παραφίνης σε ένα και μοναδικό πείραμα κάτω από αυστηρά τυποποιημένες συνθήκες, εννοώντας δηλαδή ότι όλα τα ιστικά δείγματα αναλύθηκαν με τον ίδιο, πανομοιότυπο τρόπο, χωρίς την παρέμβαση ανθρώπινου παράγοντα (unbiashed fashion) με ελάχιστη καταστροφή του ιστού, χαμηλό κόστος, συντομότερο χρόνο και με τρόπο που διευκόλυνε όχι μόνο την ποσοτική ανάλυση της χρωματικής έντασης αλλά μας βοήθησε να επικεντρώσουμε και σε ειδικές κυτταρικές σειρές, όπως οι ινοβλάστες και τα κυψελιδικά κύτταρα, των οποίων ο ρόλος στην παθογένεια της νόσου είναι πολύ σημαντικός39. Η ανάλυση των δεδομένων αποκάλυψε μειωμένη έκφραση τελομεράσης τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης στους ασθενείς με πνευμονική ίνωση σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα αποτελέσματα της qRT-PCR και της TRAP ανάλυσης συμπληρώθηκαν από ανοσοϊστοχημικές μελέτες, σε συνδυασμό με το πρόγραμμα ημιποσοτικής ανάλυσης εικόνας (semi-quantitative image analysis) που εκτιμά την ένταση του ανιχνευόμενου σήματος της χρωστικής ουσίας του προς εξέταση παρασκευάσματος, με αμερόληπτο τρόπο σε μια κλίμακα 256 χρωμάτων (τα συμβατικά μικροσκόπια αναγνωρίζουν διαφορές του σήματος σε κλίμακα 30 χρωμάτων)41,42 και έδειξαν ισχυρή πρόσληψη χρωστικής ουσίας του φυσιολογικού επιθηλίου σε αντίθεση με τις ινωτικές περιοχές. Αξιοσημείωτα, ανοσοϊστοχημικές μέθοδοι υποστηριζόμενες και από FISH ανάλυση, επεκτείνοντας πρωτοποριακές αναφορές40, ανακάλυψαν την ύπαρξη δυο διακριτών υποπληθυσμών τύπου ΙΙ πνευμονοκυττάρων με βάση τα επίπεδα έκφρασης τελομεράσης; μορφολογικά μεταλλαγμένα τελομεράση θετικά κύτταρα άμεσα προσκείμενα σε περιοχές ενεργού ίνωσης τα οποία επιδείκνυαν υψηλά επίπεδα έκφρασης δεικτών μεσεγχυματικής διαφοροποίησης όπως η Ν-καντχερίνη εντοπιζόμενα κυρίως στον IPF πνεύμονα και σε μικρότερο βαθμό στον COP πνεύμονα και τελομεράση αρνητικά κύτταρα τα οποία παρατηρήθηκαν κυρίως σε περιοχές κατεστραμμένου πνευμονικού παρεγχύματος και εγκατεστημένης ίνωσης στον IPF πνεύμονα και γύρω από περιοχές κυψελιδικής πλήρωσης και οργανούμενης πνευμονίας στα COP ιστικά δείγματα. Τα τελευταία κύτταρα φαίνεται ότι χαρακτηρίζονται από αυξημένη αποπτωτική δραστηριότητα όπως αυτή εκτιμήθηκε από τη θετική ανοσοϊστοχημική χρώση για τον παράγοντα κατακερματισμού του DNA. Περαιτέρω, παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση του ενζύμου και σε περιοχές κυψελιδικού επιθηλίου οι οποίες μακροσκοπικά τουλάχιστον φαίνονταν φυσιολογικές, εντός του IPF πνεύμονα.

Η διττή αυτή έκφραση της τελομεράσης στα προγονικά πνευμονοκύτταρα τύπου ΙΙ μας παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τον ρόλο της τελομεράσης στην παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης. Μπορούμε επομένως να υποθέσουμε ότι αλλαγές στην έκφραση της τελομεράσης δύνανται να ρυθμίζουν την μοίρα των κυψελιδικών κυττάρων είτε προς έναν αποπτωτικό φαινότυπο ή προς ένα φαινότυπο μεσεγχυματικής διαφοροποίησης, συνεισφέροντας έτσι άμεσα στην ινωτική διαδικασία (εικόνα 8). Πρόσφατα δεδομένα από δυο ανεξάρτητες γενετικές μελέτες28,41 συσχετίζουν τις μεταλλαγές στις υπομονάδες της τελομεράσης με την οικογενή IPF προτείνοντας ότι τα βραχέα, δυσλειτουργικά τελομερή στα επιθηλιακά κύτταρα μπορούν να οδηγήσουν σε απόπτωση τους και στη δημιουργία πολλαπλών ινωτικών βλαβών. Επίσης αναφέρουν ότι υπό την επίδραση πολλαπλών «επιθέσεων» το βρογχοκυψελιδικό επιθήλιο απαντά με συνεχή αναγέννηση η οποία είναι άμεσα εξαρτώμενη από τα τοπικά προγονικά κύτταρα τα οποία στην περίπτωση της ίνωσης χαρακτηρίζονται από χαμηλά επίπεδα βιοσιμότητας εξαιτίας της παρουσίας βραχέων τελομερών, προερχόμενων από τη μειωμένη έκφραση της τελομεράσης. Τα αποτελέσματα της μελέτης είναι σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση.

Τα τελομεράση αρνητικά κύτταρα είναι πιο πιθανό να αποπίπτουν όπως φάνηκε άλλωστε και από την αυξημένη έκφραση του παράγοντα κατακερματισμού του DNA, συνεισφέροντας έτσι στην ακανόνιστη, χαοτική επανεπιθηλιοποίηση που χαρακτηρίζει τη νόσο. Σε συμφωνία με αυτό, η παρουσία αυξημένων επιπέδων έκφραση τελομεράσης στα μορφολογικά μεταλλαγμένα, επιπεδωμένα, προσομοιάζοντα με μεσεγχυματικά κύτταρα, προγονικά τύπου ΙΙ πνευμονοκύτταρα τα οποία εξέφραζαν αυξημένα επίπεδα δεικτών διαφοροποίησης ίσως να σημαίνει ότι τα κύτταρα αυτά χρειάζονταν την τελομεράση για υποστούν ένα είδος μεταπλασίας, την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάπτωση22,42,43. Η εντόπιση υψηλών επιπέδων τελομεράσης στο φυσιολογικό επιθήλιο εντός του IPF πνεύμονα ίσως να αντιπροσωπεύει ένα είδος αμυντικού μηχανισμού επιβίωσης των κυψελιδικών κυττάρων ενάντια στα επαναλαμβανόμενα ερεθίσματα ιστική βλάβης που οδηγούν τελικά στην ινογένεση ή ακόμα μια αντιρροπιστική απάντηση προκειμένου να ελαττώσουν την έκταση της ινωτικής εξεργασίας, όπως ακριβώς έχει αναφερθεί σε πειραματικά μοντέλα ίνωσης.

Επιπρόσθετα αξίζει να αναφερθεί, ότι η υπερέκφραση τελομεράσης σε περιοχές ινοβλαστικής δραστηριότητας περισσότερο στον IPF από ότι στον COP πνεύμονα υποδεικνύει ένα μηχανισμό μέσω του οποίου οι ινοβλάστες της IPF με μεταλλαγμένο φαινότυπο εξασκούν την ανθεκτικότητα τους στο φαινόμενο της απόπτωσης γεγονός που μπορεί να εξηγήσει την ύφεση των ινωτικών βλαβών της COP μετά από θεραπεία με κορτικοειδή και την παραμονή της ινωτικής εξεργασίας της IPF ανεξαρτήτου θεραπευτικής αγωγής38,44. Η άμετρη συστράτευση και παραμονή ινοβλαστών μεταλλαγμένου φαινότυπου σε συνδυασμό με το φαινόμενο της επιθηλιακής – μεσεγχυματικής μετάπτωσης προσομοιάζει με τη μεταπλασία και τη γενετική εξαλλαγή των καρκινικών κυττάρων. Το αν μεταλλαγές στις υπομονάδες της τελομεράσης είναι υπεύθυνες για τη ανεπαρκή δραστηριότητα του ενζύμου και τα βραχέα τελομερή οδηγώντας σε απώλεια των κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων ή ακόμα και για την αυξημένη δράση του ενζύμου και την μεταπλασία του επιθηλίου είναι εν πολλοίς άγνωστο και διφορούμενο. Αυτό που σήμερα είναι ήδη γνωστό είναι πως μεταλλαγμένα συστατικά της τελομεράσης μπορεί να οδηγήσουν σε χρωματοσωμιακή αστάθεια, όπως συμβαίνει κατά τη μετάλλαξη ενός φυσιολογικού κυττάρου σε καρκινικό. Η ενεργοποίηση της τελομεράσης μετά την έναρξη της χρωματοσωμιακής αστάθειας σε συνδυασμό με το βεβλαμένο προϊνωτικό μικροπεριβάλλον, προάγει τη συστράτευση μεταλλαγμένων κυττάρων μέσα από μια διαδικασία που ονομάζεται ΕΜΤ (εικόνα 8). Δυο πρόσφατες, ανεξάρτητες μεταξύ τους κλινικές μελέτες22,23 συσχέτισαν τα μεταλλαγμένα συστατικά της τελομεράσης με την οικογενή IPF, δείχνοντας ότι τα μικρά δυσλειτουργικά τελομερή μπορεί να οδηγήσουν σε απόπτωση των πνευμονοκυττάρων και δημιουργία πολλαπλών ινοτικών βλαβών. Οι παραπάνω μελέτες ανέφεραν επίσης ότι σε πολλαπλά «χτυπήματα», το βρογχοκυψελιδικό επιθήλιο αναγεννιέται γεγονός που αποδίδεται στα προγονικά κύτταρα που βρίσκονται τοπικά στην περιοχή. Τα ευρήματά μας είναι σύμφωνα με την υπόθεση αυτή. Τα αρνητικά προγονικά κύτταρα της τελομεράσης είναι περισσότερο πιθανό οδηγηθούν στη απόπτωση όπως εκτιμάται από την αυξημένη έκφραση του παράγοντα αποδόμησης του DNA, συνεισφέροντας έτσι στη μη φυσιολογική επαναθηλιοποίηση που χαρακτηρίζει την παθογένεια της νόσου. Παράλληλα με αυτό, η αυξημένη χρώση της τελομεράσης και η αραίωση των πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ (εικόνα 7Β και 7Ε) που εκφράζουν δείκτες κυτταρικής διαφοροποίησης, μπορεί να δείχνουν την ανάγκη ενεργοποίησης της τελομεράσης να προάγει ΕΜΤ38,44,45.




Επιπρόσθετα, η παρουσία τελομεράσης σε περιοχές κυττάρων αυξημένης πολλαπλασιαστικότητας όπως οι ινοβλάστες των ασθενών με IPF που συγκρίθηκαν με COP, δείχνει έναν μηχανισμό αντίστασης στην απόπτωση των IPF ινοβλαστών με αλλαγμένο φαινότυπο, γεγονός που μπορεί να ερμηνεύσει τη λύση των βλαβών στους ασθενείς με COP ως απάντηση στα κορτικοστεροειδή, εν αντιθέσει με την IPF που εξακολουθεί να έχει κακή πρόγνωση παρά τη θεραπεία46,47.

Η ανίχνευση μεταλλαγών της τελομεράσης σε επιθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες απομονωθέντα από ασθενείς με διαφορετικές μορφές πνευμονικής ίνωσης μπορεί να αποτελέσει ένα βήμα μπροστά και να βοηθήσει τους κλινικούς ιατρούς ώστε να αναγνωρίζουν πρώιμα, άτομα τα οποία είναι μάλλον απίθανο να ανταποκριθούν σε ανοσοκατασταλτικούς παράγοντες.

Επιπρόσθετα, η εντόπιση της τελομεράσης στα πνευμονικά αγγειακά κύτταρα που εκφράζουν aSMA στους πνεύμονες με IPF μπορεί να εξηγήσει τον αυξημένο πολλαπλασιασμό και την αναδιαμόρφωση που χαρακτηρίζουν τα συγκεκριμένα κύτταρα και τα οποία εν τέλει οδηγούν αγγειοσύσπαση και σε ανάπτυξη δευτεροπαθούς πνευμονικής υπερτάσεως σε τελικού σταδίου πνευμονική ίνωση, μια από τις κυριότερες αιτίες θανάτου στους ασθενείς αυτούς παγκοσμίως48. Παρόλα ταύτα, περισσότερες μελέτες απαιτούνται για να τεκμηριώσουν την παραπάνω παρατήρηση.

Παρά τον σχετικό ενθουσιασμό που μπορεί να πηγάζει από τα παραπάνω αποτελέσματα και παρατηρήσεις, η μελέτη μας εμφανίζει μερικούς περιορισμούς οι οποίοι πρέπει να αντιμετωπιστούν προσεκτικά. Πρώτον, είναι ευρέως γνωστό ότι η IPF/UIP χαρακτηρίζεται από σημαντική τοπική και χρονική ετερογένεια βλαβών με την παρουσία περιοχών φυσιολογικού πνευμονικού παρεγχύματος, ενεργού ίνωσης και τελικού σταδίου ίνωση με καταστροφή του πνευμονικού ιστού. Η τεχνολογία των ιστικών μικροσυστοιχιών βασίζεται στην ανάλυση μικρών αντιπροσωπευτικών ετερογενών δειγμάτων και επομένως το πλέον εύλογο ερώτημα που γεννάται είναι το κατά πόσον μπορεί η μέθοδος αυτή να αποτυπώσει τις βιολογικές ιδιότητες μιας τόσο ετερογενής νόσου. Το ερώτημα αυτό έχει διερευνηθεί από πληθώρα επιστημόνων οι οποίοι έχουν συγκρίνει χωρίς να δουν σημαντικές διαφορές αποτελέσματα μελετών με μεγάλες ιστικές τομές και με ιστικές μικροσυστοιχίες. Επιπρόσθετα, άλλες μελέτες αποκάλυψαν ότι η πολλαπλή λήψη δειγμάτων από διαφορετικές περιοχές βλάβης ήταν επαρκής για να ανιχνεύσει κλινικοπαθολογοανατομικές συσχετίσεις χωρίς ταυτόχρονα να καταστρέψει τον ιστό. Ωστόσο είναι η πρώτη φορά που η τεχνολογία αυτή εφαρμόζεται στην έρευνα των διαμέσων πνευμονοπαθειών μιας και όλες αυτές οι μελέτες αναφέρονται σε καρκινικά δείγματα οπότε χρειάζεται αρκετός χρόνος ακόμα μέχρις ότου η τεχνολογία αυτή εγκατασταθεί στην καθημέρα ιατρική πράξη. Δεύτερον, με βάση την προσέγγιση μας δεν μπορούμε να είμαστε σίγουροι για το αν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ αυξημένης έκφραση τελομεράσης και διαφοροποίησης και χαμηλής έκφρασης και απόπτωσης. Παρά ταύτα η μελέτη μας αποτελεί ουσιαστικά την πρώτη προσπάθεια συσχέτισης της τελομεράσης με την επιθηλιακή απόπτωση και διαφοροποίηση καθώς και με τον αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό των ανθεκτικών στην απόπτωση ινοβλαστών. Λαμβάνοντας υπόψην τα παραπάνω μπορούμε να υποθέσουμε ότι οι καινούριες θεραπευτικές παρεμβάσεις που θα στοχεύουν στη διατήρηση των επιθηλιακών κυττάρων μέσω επαγωγής της έκφρασης της τελομεράσης μπορούν να αποδειχθούν σαφώς πιο αποτελεσματικές από τους τρέχοντες αντι-ινωτικούς ή ανοσοστροποιητικούς παράγοντες49.

Συμπερασματικά θα μπορούσαμε να πούμε, ότι δείξαμε μια σημαντική ελάττωση στην έκφραση της τελομεράσης σε ασθενείς με δυο διαφορετικές μορφές πνευμονικής ίνωσης συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου εμπλέκοντας έτσι για πρώτη φορά την χαμηλή δραστηριότητα του ενζύμου με την παθογένεια της ινωτικής διεργασίας. Η υποέκφραση αυτή του ενζύμου που συνοδεύτηκε από αυξημένη απόπτωση ήταν περισσότερο έντονη στα επιθηλιακά κύτταρα που περιέβαλλαν τελικού σταδίου εγκατεστημένη ίνωση. Αξιοσημείωτα, η αύξηση των επιπέδων έκφρασης της τελομεράσης δεν ήταν μόνο παρούσα στις ινοβλαστικές εστίες όπου η απόπτωση ήταν ελάχιστη αλλά και σε περιοχές υπερπλαστικού επιθηλίου άμεσα προσκείμενο σε αυτές. Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν το γεγονός ότι η τελομεράση μπορεί να ρυθμίζει την μοίρα των επιθηλιακών κυττάρων είτε προς ένα αποπτωτικό φαινότυπο ή προς ένα φαινότυπο μεσεγχυματικής διαφοροποίησης, συνεισφέροντας έτσι άμεσα στην πνευμονική ίνωση. Τέλος τα διακριτά εκφραστικά πρότυπα της τελομεράσης μεταξύ των δυο μορφών πνευμονικής ίνωσης μπορούν να εξηγήσουν και διαφορές όσον αφορά την προοδευτικότητα της νόσου και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Μελλοντικές μελ

© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE