Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Πρότυπα Ποσοτικής Ανάλυσης της Πνευμονικής Δομής: Η Ανατολή της Στερεοπνευμονολογίας
Πνεύμων 2010, 23(2):141-146

ΠΕΡIΛΗΨΗ. Οι πνεύμονες αποτελούν τρισδιάστατες δομές με πολύπλοκη κατασκευή, οι οποίες τόσο στην κλινική όσο και στο εργαστήριο μελετώνται μέσω ιστολογικών ή απεικονιστικών τομών. Παρ’ όλο που οι δισδιάστατες αναλύσεις τέτοιου τύπου θεωρούνται «χρυσό πρότυπο», οι πληροφορίες που δίνουν είναι συχνά ανεπαρκείς και μπορεί να μην αντιπροσωπεύουν όλο το όργανο. Η στερεολογία, η μαθηματική προσέγγιση στην ανάλυση τρισδιάστατων δομών μέσω δισδιάστατης δειγματοληψίας και η μορφομετρία, η πρακτική εφαρμογή της στερεολογίας, δίνουν λύση στο πρόβλημα αυτό, αλλά μέχρι πρόσφατα δεν είχαν υιοθετηθεί συστηματικά στην πνευμονολογία. Σε μία προσπάθεια ελαχιστοποίησης των παραπάνω μεθοδολογικών προβλημάτων και στην κατεύθυνση προτυποποίησης της ποσοτικής ανάλυσης της πνευμονικής δομής, η Αμερικανική Θωρακική Εταιρεία (American Thoracic Society, ATS) και η Ευρωπαϊκή Πνευμονολογική Εταιρεία (European Respiratory Society, ERS) συνέστησαν ομάδα εργασίας, η οποία πρόσφατα εξέδωσε τα πορίσματά της. Η επιτροπή έθεσε σαν στόχους την περιεκτική ανασκόπηση των συγχρόνων στερεολογικών μεθόδων μορφομετρίας πνευμόνων, τη διατύπωση πρακτικών οδηγιών για τη χρήση αντικειμενικών μεθόδων βασικής και εφαρμοσμένης έρευνας της πνευμονικής δομής και την εξέταση των προεκτάσεων των στερεολογικών μεθόδων στη μη επεμβατική απεικόνιση της πνευμονικής αρχιτεκτονικής. Στο πόρισμα της ομάδας εργασίας περιλαμβάνονται χρήσιμες κατευθύνσεις με σημαντικές εφαρμογές στο εργαστήριο και την κλινική, οι σημαντικότερες από τις οποίες συνοψίζονται στην παρούσα περιληπτική ανασκόπηση. Πνεύμων 2010, 23(2):141-146.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Το πρόβλημα


Οι πνεύμονες αποτελούν τρισδιάστατες δομές με πολύπλοκη κατασκευή στην οποία συμμετέχουν διάφοροι τύποι κυττάρων, εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, αέρας και αίμα. Σε σύγκριση με άλλα όργανα (π.χ. νεφρός), η πολυπλοκότητα της διαμόρφωσης των πνευμόνων στο χώρο επιτείνεται από τη σχετική κίνηση των δομών τους κατά την αναπνοή και από την ετερογένεια και ανισοτροπία του πνευμονικού παρεγχύματος που περιέχει στερεά και ρευστά συστατικά και διάφορα είδη κυττάρων σε αναλογίες που διαφέρουν στις διάφορες περιοχές του οργάνου (π.χ. κεντρικές έναντι περιφερικών περιοχών). Η κατανόηση της φυσιολογικής αναπνευστικής λειτουργίας, της εμβρυολογικής ανάπτυξης και μετέπειτα αύξησης των πνευμόνων, των μηχανισμών και επιπτώσεων των αναπνευστικών νοσημάτων, καθώς και των αποτελεσμάτων διαφόρων θεραπευτικών παρεμβάσεων, προϋποθέτει τη συλλογή πληροφοριών για την τρισδιάστατη δομή των πνευμόνων. Οι πληροφορίες αυτές ανακτώνται τρεχόντως από δισδιάστατες ιστολογικές ή απεικονιστικές τομές των πνευμόνων και χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή συμπερασμάτων για τη δομή και λειτουργία των πνευμόνων σαν σύνολο. Παρ’ όλο που η δομική ανάλυση (ιστολογική ή απεικονιστική) των πνευμόνων θεωρείται «χρυσό πρότυπο» για την εκτίμηση της βαρύτητας διαφόρων νοσημάτων, του αποτελέσματος θεραπευτικών στρατηγικών και των επιπτώσεων πειραματικών παρεμβάσεων, οι πληροφορίες που προέρχονται από δισδιάστατη δειγματοληψία της τρισδιάστατης κινητής δομής που ονομάζεται πνεύμονας είναι συχνά ανεπαρκείς και μπορεί να οδηγήσουν σε εσφαλμένα συμπεράσματα.

Στερεολογία

Απάντηση στο πρόβλημα δίνει η στερεολογία, μία συστηματική μαθηματική προσέγγιση της ανάλυσης τρισδιάστατων δομών μέσω δισδιάστατης δειγματοληψίας. Παρ’ όλο που η μέθοδος εφαρμόστηκε για πρώτη φορά στον πνεύμονα πριν από 40 χρόνια1-3 και έχει αναπτύξει συνεκτική και πλήρη φαρέτρα αναλυτικών εργαλείων4, δεν είχαν υιοθετηθεί μέχρι πρόσφατα μεθοδολογικά πρότυπα όπως στις περιπτώσεις του νεφρού και του εγκεφάλου. Σε μία προσπάθεια ελαχιστοποίησης των παραπάνω μεθοδολογικών προβλημάτων και στην κατεύθυνση προτυποποίησης της ποσοτικής ανάλυσης της πνευμονικής δομής, η Αμερικανική Θωρακική Εταιρεία (American Thoracic Society, ATS) και η Ευρωπαϊκή Πνευμονολογική Εταιρεία (European Respiratory Society, ERS) συνέστησαν ομάδα εργασίας, η οποία πρόσφατα εξέδωσε τα πορίσματά της σε μία κοινή επίσημη θέση των δύο εταιρειών5. Η επιτροπή έθεσε σαν στόχους την περιεκτική ανασκόπηση των συγχρόνων στερεολογικών μεθόδων της μορφομετρίας των πνευμόνων, τη διατύπωση πρακτικών οδηγιών για τη χρήση αντικειμενικών μεθόδων βασικής και εφαρμοσμένης έρευνας της πνευμονικής δομής και την εξέταση των προεκτάσεων των στερεολογικών μεθόδων στη μη επεμβατική απεικόνιση της πνευμονικής αρχιτεκτονικής. Στο πόρισμα της ομάδας εργασίας περιλαμβάνονται χρήσιμες κατευθύνσεις με σημαντικές εφαρμογές στο εργαστήριο και την κλινική, οι σημαντικότερες από τις οποίες συνοψίζονται στην παρούσα περιληπτική ανασκόπηση. Οι πνευμονολόγοι, ακτινολόγοι ή παθολογοανατόμοι με κλινικά ή ερευνητικά ενδιαφέροντα που ενδιαφέρονται να εντρυφήσουν ενδελεχέστερα στο αντικείμενο παραπέμπονται στο προαναφερθέν και άλλα λεπτομερέστερα κείμενα4-14.

ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ


Αρχές στερεολογίας

Όπως προαναφέρθηκε, η στερεολογία αναφέρεται στις μαθηματικές μεθόδους προσδιορισμού των φυσικών ιδιοτήτων ακανόνιστων τρισδιάστατων δομών χρησιμοποιώντας δισδιάστατες τομές, φυσικές ή οπτικές. Ο όρος μορφομετρία αναφέρεται στη μέτρηση της μορφής και αφορά κυρίως την πρακτική εφαρμογή της στερεολογίας. Οι παράμετροι μίας τρισδιάστατης δομής όπως ο πνεύμονας μπορεί να έχουν τρεις (όγκος ή μέγεθος), δύο (εμβαδό επιφάνειας), μία (μήκος ή πάχος) ή καμία (αριθμός) διάσταση και προσδιορίζονται με δειγματοληψία και υπολογισμό, τα δύο κύρια βήματα της στερεολογίας. Η δειγματοληψία πρέπει να είναι απόλυτα τυχαία και αμερόληπτη, ενώ τα αποτελέσματα θα πρέπει να αναπαράγονται με διαφορετικές δειγματοληψίες. Οι στερεολογικοί υπολογισμοί αποτελούν συχνά απλές μετρήσεις του αριθμού των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των δομών ενδιαφέροντος και απλών γεωμετρικών σχημάτων (γνώμονες) και διέπονται από τις εξής αρχές: α) Ο εκάστοτε γνώμονας καθορίζει τη μετρούμενη παράμετρο, ώστε το άθροισμα των διαστάσεων της παραμέτρου και του γνώμονα να ισούται με τρία (Εικόνα 1 και Πίνακας 1). β) Οι στερεολογικές μετρήσεις αποτελούν πυκνότητες ή λόγους (ποσοστά) και πρέπει να ανάγονται σε κάποιον όγκο αναφοράς (π.χ. όγκος πνευμόνων ή κυψελίδων) ώστε να έχουν νόημα. γ) Η μέτρηση αριθμού σωματιδίων (καμία διάσταση) δεν μπορεί να μετρηθεί σε δισδιάστατες τομές και απαιτεί χρήση ζευγών τομών, φυσικών (ιστολογικών) ή οπτικών, που χωρίζονται από γνωστή απόσταση (δίτομο), δημιουργώντας έτσι τρισδιάστατο χώρο μελέτης με όγκο ίσο με το γινόμενο επιφάνειας τομών επί την απόσταση μεταξύ των δύο τομών.






Προετοιμασία πνευμονικού ιστού


Η προετοιμασία του πνευμονικού ιστού για στερεολογική μορφομετρία στοχεύει στη βέλτιστη διατήρηση του πνευμονικού όγκου σε συγκεκριμένη φάση της αναπνοής, της αρχιτεκτονικής του πνευμονικού παρεγχύματος, των βιολογικών υγρών του πνεύμονα (αίμα, κυψελιδικό υγρό), καθώς και της μοριακής ταυτότητας των κυττάρων του πνεύμονα για μετέπειτα ταυτοποίηση πρωτεϊνών (ανοσοϊστοχημεία) ή/και νουκλεϊκών οξέων (in situ ανοσοφθορισμός). Καμία μέθοδος δεν επιτυγχάνει όλους τους παραπάνω στόχους ώστε να θεωρηθεί «χρυσό πρότυπο», αλλά μερικοί στόχοι επιτυγχάνονται καλύτερα με συγκεκριμένες μεθόδους (Πίνακας 2). Μία προτιμώμενη μέθοδος που επιτρέπει άριστη διατήρηση κυψελιδικών και τριχοειδικών δομών και αίματος αλλά όχι του κυψελιδικού υγρού, η μονιμοποίηση μέσω των αεραγωγών (διατραχειακή), γίνεται βέλτιστα με ταχεία διατραχειακή έγχυση 2,5% γλουταραλδεΰδης (ωσμωτική πίεση 350 Osm, pH 7,4) υπό πίεση 20-25 cmH2O για 24 ώρες. Η μονιμοποίηση μέσω των αγγείων (διαπνευμονική) επιτυγχάνει διατήρηση των κυψελιδικών και τριχοειδικών δομών καθώς και κυψελιδικού υγρού, αλλά όχι του αίματος και συνιστάται να πραγματοποιείται μέσω έγχυσης στην πνευμονική αρτηρία συνδυασμού 2,5% γλουταραλδεΰδης – 3% δεξτράνης (ωσμωτική πίεση 510 Osm, pH 7,4), ακολουθούμενης διαδοχικά από 1% τετροξειδίου οσμίου, 0,5% οξεικού ουρανίου και 70-100% αιθανόλης. Τέλος, ως βέλτιστη μέθοδος που επιτρέπει τόσο στερεολογική μορφομετρία όσο και ανοσοϊστοχημεία προτείνεται η έγχυση 4% φορμαλδεΰδης με 0,1% γλουταραλδεΰδη σε 0,2 Μ HEPES μέσω τραχείας ή πνευμονικής αρτηρίας ακολουθούμενη από υποκατάσταση ψύξης με 0,5% οξεικό ουράνιο σε μεθανόλη.



Δειγματοληψία


Για να αντιπροσωπεύουν τα δείγματα πνευμονικού ιστού που εξετάζονται όλον τον πνεύμονα πρέπει όλα τα πνευμονικά τμήματα να έχουν την ίδια πιθανότητα να εξεταστούν. Αυτό επιτυγχάνεται καλύτερα με τυχαιοποίηση της δειγματοληψίας, σύμφωνα, μεταξύ άλλων, με τις μεθόδους της συστηματικής, διαστρωματωμένης ή ισοτροπικής ομοιόμορφα τυχαιοποιημένης δειγματοληψίας και των καθέτων τομών. Για μικρούς πνεύμονες τρωκτικών αρκούν συνήθως 100-200 μετρήσεις, 50 οπτικά πεδία, και 10 δείγματα ιστού από κάθε ζεύγος πνευμόνων.

Παράμετροι αναφοράς

Oι μορφομετρικές μέθοδοι συνήθως δίνουν αποτελέσματα σε μονάδες πυκνότητας ή λόγους (ποσοστά), τα οποία έχουν κάποιο νόημα μόνο όταν αναφέρονται σε κάποιο όγκο αναφοράς, π.χ. τον όγκο των πνευμόνων ή των κυψελίδων. Για τη μέτρηση του όγκου των πνευμόνων, χρησιμοποιούνται η φυσική μέθοδος εμβάπτισης και η ιστολογική ή απεικονιστική μέθοδος του Cavalieri. Κατά τη μέθοδο εμβάπτισης οι πνεύμονες καταβυθίζονται σε φυσιολογικό ορό και μετράται ο εκτοπιζόμενος όγκος ορού, ενώ κατά Cavalieri οι πνεύμονες τέμνονται σε παράλληλες τομές ίσου πάχους t και ο συνολικός όγκος των πνευμόνων V υπολογίζεται σαν το γινόμενο του πάχους των τομών t επί το άθροισμα των εμβαδών A της κάθε τομής (V = t • ΣA). Η πρώτη μέθοδος υπερεκτιμά τον όγκο κατά 10-15% αλλά είναι τεχνικά ευκολότερη, προσφέρεται δε ιδιαίτερα για μικρούς πνεύμονες (π.χ. τρωκτικών). Όγκοι αναφοράς που αποτελούν υποσύνολα του όγκου των πνευμόνων υπολογίζονται στερεομετρικά στο μικροσκοπικό επίπεδο, όπως περιγράφεται αναλυτικότερα παρακάτω (Εικόνα 2).



Μορφομετρία πνευμονικού παρεγχύματος

Συνιστάται διαδοχική εξέταση των πνευμόνων σε όλο και μεγαλύτερη μεγέθυνση, από το μακροσκπικό στο υπερμικροσκοπικό επίπεδο. Για τον υπολογισμό όγκων (π.χ. όγκος νεοπλασματικού ιστού, όγκος διάμεσου ιστού, όγκος αγγείων) χρησιμοποιείται μέτρηση σημείων, για υπολογισμό επιφάνειας (π.χ. κυψελίδων) μέτρηση του μήκους προτύπων γραμμών που περιέχονται στη δομή ενδιαφέροντος, ενώ για τον υπολογισμό αριθμού σχηματισμών (π.χ. όγκων, κυψελίδων) η μέθοδος των διτόμων (disectors). Με βάση αυτές τις μετρήσεις, υπολογίζεται έμμεσα το μέσο μέγεθος σχηματισμών (π.χ. κυψελίδων, όγκων) ως το πηλίκο του συνολικού τους όγκου δια του αριθμού τους, όπως επίσης και πολύπλοκα μεγέθη σαν το πάχος του κυψελιδοτριχοειδικού φραγμού και τη διαχυτική ικανότητα των πνευμόνων. Χρησιμοποιώντας παρόμοιες μεθόδους είναι δυνατή η ανάλυση των υπερμικροσκοπικών, αεροφόρων, αγγειακών και άλλων δομών των πνευμόνων.

Βιοψίες

Η στερεολογική ανάλυση ανοικτών, διαβρογχικών και διαθωρακικών βιοψιών πνεύμονα ενέχει διάφορα προβλήματα και πρέπει να επιχειρείται με επιπλέον προσοχή. Οι βιοψίες αυτές δεν γίνονται σε τυχαία σημεία, ο ιστός είναι συχνά συνθλιμμένος, οι τεχνικές μονιμοποίησης δεν είναι βέλτιστες και δεν μπορεί να υπολογιστεί ο όγκος αναφοράς παρά μόνο απεικονιστικά.

Ποσοτική δομική ανάλυση και in vivo απεικόνιση


Η στερεολογία μπορεί να συνδυαστεί με σύγχρονες απεικονιστικές τεχνικές όπως η υπολογιστική τομογραφία. Οι απεικονιστικές τεχνικές πρέπει να συμπληρώνονται και να επικυρώνονται με μικροσκοπική στερεομετρία. Επίσης, τα πυκνότερα στοιχεία των πνευμόνων (μεσοκυψελιδικό διάφραγμα, όγκοι) πιθανά υπερπροβάλονται και υπερεκτιμώνται απεικονιστικά.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

Η στερεολογία χαρακτηρίζεται από ακρίβεια, αντικειμενικότητα και αποτελεσματικότητα και παρέχει πλήρη φαρέτρα εργαλείων για δειγματοληψία και μορφομετρία ακανόνιστων δομών. Τα εργαλεία αυτά είναι προσαρμόσιμα σε διάφορες τεχνικές απεικόνισης και έχουν καταστεί χρυσό πρότυπο για την ποσοτική δομική ανάλυση διαφόρων οργάνων, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων. Η πρόσφατη θέσπιση προτύπων για τη στερεομετρία πνεύμονα από την Αμερικανική Θωρακική Εταιρεία (American Thoracic Society, ATS) και την Ευρωπαϊκή Πνευμονολογική Εταιρεία (European Respiratory Society, ERS) αναμένεται να συμβάλλουν σημαντικά στην αποτελεσματικότερη και ακριβέστερη ανάλυση της πνευμονικής δομής στην κλινική και στο εργαστήριο και στην περαιτέρω ανάπτυξη της έρευνας των αναπνευστικών νοσημάτων.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

(Βλέπε αγγλικό κείμενο)
© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE