Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Επίδραση της χαμηλής δόσης ενδοτοξίνης (LPS) σε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα πριν από έκθεση σε όζον. Διαφορές ανάμεσα σε ποντικούς άγριου τύπου και με γενετική εξάλειψη του επιφανειοδραστικού παράγοντα πρωτεΐνη Α
ΠΕΡIΛΗΨΗ. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ: Πολλές παράμετροι της φλεγμονώδους απάντησης σε ένα βλαπτικό ερέθισμα [όπως είναι η έκθεση σε όζον συγκέντρωσης 2 μέρη/εκατομμύριο (ppm) για 3 ή 6 ώρες] είναι λιγότερο ισχυρές σε ποντικούς με γενετική εξάλειψη (knock out, KO) του επιφανειοδραστικού παράγοντα Α (SP-A) σε σχέση με ποντικούς άγριου τύπου (wild type, WT). Διατυπώσαμε την υπόθεση ότι ένα ήπιο ερέθισμα [για παράδειγμα μια χαμηλή δόση λιποπολυσακχαρίδης (LPS)] έχει αρνητική επίδραση στη άμυνα του ξενιστή και διαφοροποιεί την επαγόμενη από όζον βλάβη σε ποντικούς τύπου WT και ΚΟ. ΜΕΘΟΔΟΣ: Σε ποντικούς WT και ΚΟ χορηγήθηκαν διαφορετικές δόσεις LPS, ή LPS (2 ng) + όζον (O3, 2 ppm), ή διηθημένος αέρας (filtered air, FA) επί 3 ώρες. Οι ποντικοί θανατώθηκαν 4 ώρες μετά την έκθεση (σε O3 ή FA) ή συνολικά 20 ώρες μετά τη χορήγηση LPS. Στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) προσδιορίστηκαν πολλαπλά τελικά σημεία ενδεικτικά φλεγμονής. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: 1) Στις 20 ώρες μετά από χορήγηση μόνο LPS, και οι δύο ομάδες ποντικών εμφάνισαν σημεία φλεγμονής. Διαπιστώθηκαν διαφορές στο πρότυπο απάντησης της ΜΙΡ-2, στον ολικό αριθμό κυττάρων (στην ομάδα των 0,5 ng LPS) και στα αρχικά επίπεδα οξειδωμένων πρωτεϊνών και φωσφολιπιδίων. 2) Οι ποντικοί ΚΟ εμφάνισαν μείωση των πολυμορφοπύρηνων (ΡΜΝ) και της ΜΙΡ-2 και αύξηση των φωσφολιπιδίων μετά από έκθεση σε LPS + O3, καθώς και αύξηση του ολικού αριθμού κυττάρων μετά από LPS + FA. 3) Οι ποντικοί WT στους οποίους χορηγήθηκε LPS + FA εμφάνισαν αύξηση του SP-A, η οποία δεν επιτάθηκε στην ομάδα χορήγησης LPS + O3, καθώς και αύξηση των διμερών οξειδωμένου SP-A μετά από έκθεση σε O3 ή LPS + O3. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η χορήγηση LPS έχει αρνητικές επιπτώσεις οι οποίες εκδηλώνονται μεγάλο χρονικό διάστημα μετά την έκθεση και καθιστά τους ποντικούς ΚΟ λιγότερο ικανούς να ανταποκριθούν σε ένα δεύτερο βλαπτικό ερέθισμα. Η χορήγηση LPS και η έκθεση σε O3 επιδρούν στον SP-A ποσοτικά και ποιοτικά, αντίστοιχα. Πνεύμων 2009, 22(2):131-142 “Duty is liberating. It forces you to transcend your own limitations and makes you do things that may not come naturally, but must be done, because they are right.” David Rockefeller

EIΣΑΓΩΓΗ

Η λιποπολυσακχαρίδη (lipoopolysaccharide, LPS) ή ενδοτοξίνη αποτελεί βασικό συστατικό της εξωτερικής μεμβράνης των Gram- αρνητικών βακτηρίων. Αποτελείται από το λιπίδιο Α, έναν πολυσακχαριδικό πυρήνα και το αντιγόνο Ο και συνιστά έναν ισχυρό επαγωγέα της φυσικής ανοσίας. Η εισπνοή ενδοτοξίνης προκαλεί επιστράτευση φλεγμονωδών κυττάρων και επάγει την παραγωγή πλήθους προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Ένας σημαντικός αριθμός πρόσφατων μελετών αποκάλυψε ότι η ανοσιακή απάντηση στην ενδοτοξίνη εκδηλώνεται μέσω της αλληλεπίδρασής της με το σύμπλεγμα υποδοχέα CD14/TLR4/MD2, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ενδοκυττάριων οδών του NFκΒ, οι οποίες μετέχουν στην παραγωγή κυτταροκινών σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, ιδιαίτερα στα μακροφάγα.1-4 Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, ο TLR-4 είναι ένας άλλος βασικός παράγοντας για την πλήρη εκδήλωση της πνευμονικής βλάβης επαγόμενης από όζον.5,6 Η εισπνοή υψηλών συγκεντρώσεων (100 μg) LPS πριν από έκθεση σε όζον έχει διαπιστωθεί ότι ενισχύει τη δράση του και επάγει την ανάπτυξη φλεγμονής στον πνεύμονα.7,8

Το όζον αποτελεί ένα ισχυρά τοξικό συστατικό του φωτοχημικού νέφους και έναν από τους κύριους υπεύθυνους της ατμοσφαιρικής ρύπανσης. Αντιδρά κατά κύριο λόγο με μόρια που βρίσκονται στο διαχωριστικό όριο υγρής- αέριας φάσης, επειδή η χαμηλή διαπερατότητά του στο νερό περιορίζει την ικανότητα διάχυσής του σε αυτούς τους ιστούς. Οι βιολογικές επιδράσεις του όζοντος σχετίζονται με την ανάπτυξη οξειδωτικού στρες στο κατώτερο αναπνευστικό σύστημα και πιθανότατα με άμεση βλάβη του επιθηλίου, καθώς και με την πυροδότηση ενός φλεγμονώδη καταρράκτη που προκαλεί έμμεσες βλάβες.9-11 Οι επαγόμενες από το όζον μεταβολές στον πνεύμονα περιλαμβάνουν εισροή και ενεργοποίηση ανοσιακών κυττάρων και αύξηση των προφλεγμονωδών κυτταροκινών και χυμοκινών, μεταξύ των οποίων είναι η χημειοτακτική πρωτεΐνη των μονοκυττάρων (MCP-1) και η φλεγμονώδης πρωτεΐνη των μακροφάγων τύπου 2 (ΜΙΡ-2).7,8,12-14 Η έκθεση σε όζον προκαλεί επίσης δυσλειτουργία της επιφανειοδραστικής ουσίας,15,16 αν και οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς.

Η επιφανειοδραστική ουσία του πνεύμονα είναι ένα σύνθετο μίγμα από λιπίδια και πρωτεΐνες. Εκτός από την πρόληψη της σύμπτωσης των κυψελίδων, τα συστατικά της παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού εναντίων διάφορων βλαπτικών ερεθισμάτων. Ο επιφανειοδραστικός παράγων πρωτεΐνη Α (SP-A) αποτελεί ένα βασικό πρωτεϊνικό συστατικό της επιφανειοδραστικής ουσίας, το οποίο συμμετέχει σε πολλές λειτουργίες και ιδιαίτερα στην ανάπτυξη της φυσικής ανοσίας (ανασκοπείται αναλυτικά στις αναφορές 17-20). Στην τελευταία περίπτωση, ο SP-A φαίνεται ότι ενισχύει τη φαγοκυττάρωση ενός αριθμού μικροοργανισμών,21-27 ρυθμίζει την ενεργοποίηση του συμπληρώματος28 και αυξάνει την παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου και αζώτου (RONS), οι οποίες συνιστούν ένα μηχανισμό φόνευσης των παθογόνων.22,29,30 Η διαταραχή αυτών των λειτουργιών σε ποντικούς SP-A -/- (ΚΟ) τους καθιστά περισσότερο επιρρεπείς σε πνευμονία.27,30-32 Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις συμμετοχής του SP-A στη ρύθμιση της φλεγμονής, ιδιαίτερα στα πλαίσια της πνευμονικής βλάβης και αποκατάστασης, μέσω ρύθμισης των προφλεγμονωδών κυτταροκινών,2,14,33 κάθαρσης των αποπτωτικών κυττάρων34,35 και ρύθμισης του κολλαγόνου και των μεταλλοπρωτεασών της θεμέλιας ουσίας.36,37 Μεγάλος αριθμός μελετών έχει δείξει ότι πολλές λειτουργίες του SP-A καταστέλλονται κατά την οξείδωση38-41 ή τη νίτρωση.42-45 Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι η οξείδωση του SP-A αυξήθηκε ταχύτατα μετά από έκθεση σε όζον και μάλιστα πριν από την οξείδωση άλλων πρωτεϊνών.14 Επίσης, δείξαμε ότι με την προοδευτική γήρανση των ποντικών, ο SP-A υφίσταται δυσανάλογα αυξημένη καρβονυλίωση συγκριτικά με άλλες πρωτεΐνες του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BAL), γεγονός που υποδηλώνει αυξημένη ευπάθειά του στην οξείδωση.46 Θεωρήσαμε ότι αφενός η δυσλειτουργία αυτή ενδέχεται να οφείλεται σε οξείδωση και, αφετέρου, λόγω της προαναφερθείσας ευπάθειας, ο SP-A μπορεί να συμμετέχει στον περιορισμό της ιστικής βλάβης μέσω εξουδετέρωσης των RONS.14

Η οξεία πνευμονική βλάβη έχει φανεί ότι μεταβάλλει τα επίπεδα της επιφανειοδραστικής ουσίας στο BAL, αλλά οι υπεύθυνοι μηχανισμοί δεν έχουν ακόμα διαλευκανθεί, καθώς έχουν διαπιστωθεί τόσο αυξημένα όσο και μειωμένα επίπεδα φωσφολιπιδίων μετά από επαφή με LPS.16,47-49 Τα λιπίδια της επιφανειοδραστικής ουσίας, αν και είναι κυρίως υπεύθυνα για τη μείωση της επιφανειακής τάσης, μπορούν επίσης να επηρεάσουν τη συμπεριφορά των ανοσιακών κυττάρων. Συγκεκριμένα, καταστέλλουν την ενεργοποίησή τους και αναστέλλουν την παραγωγή και την απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτταροκινών.50,51 Παρόλα αυτά, όπως και ο SP-A, μπορούν να οξειδωθούν από το όζον ή από ενδογενείς RONS,39,40,44,52-55 με αποτέλεσμα την τροποποίηση της δράσης τους και πιθανότατα τη συμμετοχή τους στη φλεγμονή που προκαλείται μετά από έκθεση σε όζον.

Έχουμε δείξει παλαιότερα ότι η έκθεση σε όζον συσχετίζεται με μεταβολές της φυσικής ανοσίας και με φλεγμονώδεις διεργασίες, τόσο σε ποντικούς ΚΟ όσο και σε άγριου τύπου (WT). Ωστόσο, παρατηρήσαμε ορισμένες διαφορές μεταξύ των δύο τύπων ποντικών, οι οποίες υποδηλώνουν ότι ο SP-A ενδέχεται να παίζει κάποιο ρόλο ως πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού. Είναι γνωστό ότι η βλάβη ή η ανοσιακή απάντηση που προκαλείται από συνδυασμό τοξικών παραγόντων δεν μπορεί να προβλεφθεί από την εκτίμηση της επίδρασης κάθε τοξικού παράγοντα μεμονωμένα. Με βάση αυτό το δεδομένο, η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε με σκοπό τη μελέτη της επίδρασης της χορήγησης χαμηλής δόσης LPS πριν από έκθεση σε όζον ποντικών οι οποίοι διέθεταν ακέραιη άμυνα (WT) και ποντικών SP-A ΚΟ, δηλαδή ποντικών από τους οποίους έχει εξαλειφθεί ο φυσικός αμυντικός παράγοντας SP-A. Στόχος μας ήταν η διαπίστωση αν τα πειραματόζωα που έλαβαν χαμηλή ποσότητα LPS αρκετές ώρες πριν την έκθεση στο όζον είχαν ευαισθητοποιηθεί, μέσω τροποποίησης της απάντησής τους στο οξειδωτικό στρες που παράγεται από το τοξικό όζον. Εστιάσαμε στα πρώιμα αποτελέσματα, τα οποία παρατηρήθηκαν μέσα σε 4 ώρες από τη χορήγηση όζοντος, χρονικό όριο στο οποίο είχαν διαπιστωθεί σημαντικές μεταβολές σε πολλά σχετικά τελικά σημεία, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες.14

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Πειραματόζωα

Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν αρσενικά ποντίκια WT ελεύθερα παθογόνων και αρσενικά ποντίκια SP-A ΚΟ στο γενετικό υπόστρωμα C57BL/6. Οι ποντικοί WT προήλθαν από τα εργαστήρια Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), ενώ παρέμειναν υπό καθορισμένες περιβαλλοντικές συνθήκες στα εκτροφεία του Penn State College of Medicine. Οι ποντικοί ΚΟ διατηρήθηκαν ελεύθεροι παθογόνων σε ειδικό χώρο υπό αποστειρωμένες συνθήκες, στις ίδιες εγκαταστάσεις. Και οι δύο τύποι ποντικών σιτίζονταν ελεύθερα με ειδική τροφή για τρωκτικά και με νερό βρύσης. Το σωματικό τους βάρος κυμαινόταν μεταξύ 20-25 g. Η μελέτη έλαβε έγκριση από την επιτροπή Institutional Animal Care and Use Committee του Penn State College of Medicine.

Ανταπόκριση στη δόση LPS

Οι αρσενικοί ποντικοί WT ηλικίας 5-6 εβδομάδων (n = 4 ποντικοί/χρονικό σημείο) έλαβαν μια εφάπαξ δόση (0,2, 0,5, 1, 2, 50, ή 200 ng) επεξεργασμένης LPS (Escherichia coli 055:b5; Sigma, St. Louis, MO) σε 50 μl φυσιολογικό ορό ενδοφαρυγγικά. Παράλληλα, οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου έλαβαν ίσο όγκο φυσιολογικού ορού ενδοφαρυγγικά. Και οι δύο όγκοι εγχύθηκαν στο φάρυγγα των αναισθητοποιημένων ποντικών, οι οποίοι τα εισέπνευσαν, ενώ στη συνέχεια ανένηψαν από την αναισθησία χωρίς εμφανή συμπτώματα νόσησης. Σύμφωνα με τα ευρήματα από τον τύπο WT, δύο χαμηλές δόσεις LPS που βρέθηκαν να έχουν διεγερτική επίδραση στη φλεγμονή επιλέχθηκαν για μελέτη και στον τύπο ΚΟ. Οι ποντικοί ΚΟ ηλικίας 5-6 εβδομάδων (n = 4 ποντικοί/χρονικό σημείο) έλαβαν μια εφάπαξ δόση LPS (0,5 ή 2 ng/ποντικός/50 μl φυσιολογικού ορού). Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου έλαβαν ίσο όγκο φυσιολογικού ορού ενδοφαρυγγικά. Όλα τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν 20 ώρες μετά τη χορήγηση LPS με αφαίμαξη, μετά από αναισθητοποίηση με αλοθάνη. Το χρονικό όριο των 20 ωρών επιλέχθηκε σύμφωνα με στοιχεία από έναν αριθμό δημοσιευμένων μελετών, οι οποίες διαπίστωσαν την εγκατάσταση βλάβης επαγόμενης από LPS μέσα σε 24 ώρες από τη χορήγησή της.56-58 Από όλους τους πνεύμονες απομονώθηκε το BAL με φυσιολογικό ορό.

Χορήγηση LPS ακολουθούμενη από έκθεση σε όζον

Για τα επόμενα πειράματα επιλέχθηκε η δόση των 2 ng, καθώς συνδύαζε την χαμηλή συγκέντρωση LPS με την επίδραση σε πολλές εκβάσεις. Ποντικοί WT και ΚΟ ηλικίας 5-6 εβδομάδων (20-25 g) (n = 4 ποντικοί/ χρονικό σημείο) έλαβαν μια εφάπαξ δόση LPS (2 ng) σε 50 μl φυσιολογικού ορού, ενώ παράλληλα οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου έλαβαν ίσο όγκο φυσιολογικού ορού ενδοφαρυγγικά. Δεκατρείς ώρες μετά τη χορήγηση LPS, τα πειραματόζωα εκτέθηκαν σε διηθημένο αέρα (filtered air, FA) ή σε 2 ppm όζοντος για 3 ώρες. Και τα δύο πειράματα πραγματοποιήθηκαν ταυτόχρονα σε θερμοκρασία δωματίου με επίπεδα υγρασίας 50%.14 Εν συντομία, οι 4 ποντικοί τοποθετήθηκαν αρχικά σε γυάλινα δοχεία με συρμάτινα πώματα και στη συνέχεια σε ένα κλειστό γυάλινο θάλαμο. Χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα παραγωγής όζοντος, το οποίο αποδίδει με μεγάλη αποτελεσματικότητα συγκεντρώσεις όζοντος μεταξύ 0,1 ppm και 10 ppm.59 Η παραγωγή του έγινε από έναν οζονιστή ηλεκτρικής εκκένωσης (Model OZ2SS-SS, Ozotech, Yreka, CA) και η συγκέντρωσή του παρακολουθήθηκε με έναν αναλυτή όζοντος υπεριώδους ακτινοβολίας (Model 400A, Advanced Pollution Instrumentation, San Diego, CA). Τέσσερεις ώρες μετά τη λήξη της έκθεσης, οι ποντικοί θυσιάστηκαν (συνολικός χρόνος 20 ώρες μετά τη χορήγηση LPS) με αφαίμαξη μετά από αναισθητοποίηση. Στη συνέχεια, από τους πνεύμονες απομονώθηκε το BAL με φυσιολογικό ορό.

Κυτταρολογικές μετρήσεις και βιοχημικές αναλύσεις στο υγρό BAL

Το BAL απομονώθηκε με ενστάλαξη στον πνεύμονα όγκου ίσου με το 80% της ζωτικής του χωρητικότητας για τρεις συνεχόμενες φορές (συνολικά 1,5 ml), μέσω ενδοτραχειακού καθετήρα. Ο όγκος παραγόμενου υγρού ήταν συνολικά 90% του χρησιμοποιούμενου και δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των ομάδων μελέτης και ελέγχου. Το υγρό BAL φυγοκεντρήθηκε (150 x g, 5 min, 4 oC) και το ίζημα μετατράπηκε ξανά σε εναιώρημα με διάλυμα χλωριούχου νατρίου 0,9%. Ακολούθησε κυτταρολογική μέτρηση σε κυτταρομετρητή αίματος και φυγοκέντρηση για τη διάκριση των κυτταρικών τύπων. Το ελεύθερο κυττάρων υπερκείμενο υγρό ψύχθηκε στους – 80 oC για περαιτέρω βιοχημικές αναλύσεις. Η συγκέντρωση ολικών πρωτεϊνών προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία Micro BCA Protein Assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Για τον προσδιορισμό των ολικών φωσφολιπιδίων, 100 μl υπερκείμενου υποβλήθηκαν σε λυοφιλοποίηση και στη συνέχεια στη δοκιμασία ποσοτικού προσδιορισμού Phospholipids B Assay (WAKO Chemicals Inc, Richmond, VA).

ELISA κυτταροκινών


Οι συγκεντρώσεις MCP-1 και MIP-2 προσδιορίστηκαν σε δείγματα BAL ελεύθερα κυττάρων με τη χρήση κυτίων ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής μεθόδου (ELISA), τα οποία διατίθενται στο εμπόριο (R&D systems, McKinley Place, NE). Τα όρια ανίχνευσης αυτών των κυτίων είναι 1,5 pg/ml για την ΜΙΡ-2 και 2 pg/ml για την MCP-1. Συνοπτικά, 500 μl BAL ελεύθερου κυττάρων λυοφιλοποιήθηκαν και στη συνέχεια αναμίχθηκαν με το διαλύτη του κυτίου σε τελικό όγκο 100 μl. Η δοκιμασία διενεργήθηκε σύμφωνα με τις συστάσεις των κατασκευαστών. Μετά την ολοκλήρωση του πειράματος, μετρήθηκε η απορρόφηση στα 450 nm με τη συσκευή SPECTRA Fluor Plus ELISA plate reader (Tecan US, Research Triangle Park, NC).

Ανοσοαποτύπωση του SP-A

Τα επίπεδα SP-A στο BAL προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης dot blot. Συγκεκριμένα, έγινε αραίωση 25 μl υγρού BAL ελεύθερου κυττάρων σε 975 μl διαλύματος TBS 0,02 Μ με pΗ 7,5. Το δείγμα κλασματοποιήθηκε ανά 200 μl και κάθε κλάσμα τοποθετήθηκε σε κατάλληλο μέσο μεταφοράς Bio-Rad Trans Blot (νιτροσελλουλόζη, 0,45 μm) υπό συνθήκες κενού αέρος και σε συσκευή dot blot 96 θέσεων (Bio-Rad, Hercules, CA). Ακολούθησε ολονύκτια επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου/ καλίου 0,01 Μ (PBS, pΗ 7,2), το οποίο περιείχε 1% βόεια λευκωματίνη ορού (BSA). Κατόπιν, τα δείγματα επωάστηκαν με πολυκλωνικά IgG anti-SP-A αντισώματα κονίκλου (1: 10.000)60 σε διάλυμα PBS με 1% BSA και 0,05% Tween-20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησαν τρεις εκπλύσεις επί 10 λεπτά με PBS και 0,5% Tween-20. Ακολούθησε επώαση των δειγμάτων με δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο με HRP αντίσωμα IgG εριφίου, 1:25.000) (Bio-Rad) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια εκπλύθηκε όπως προηγουμένως. Η πρόσδεση του αντισώματος ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL). Συγκεκριμένα, τα δείγματα επωάστηκαν με 10 ml κάθε διαλύματος ECL (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA) για 1 λεπτό και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν μέσα σε φάκελο σελλοφάνης, αφαιρέθηκε η περίσσεια διαλύματος και φωτογραφήθηκαν σε φιλμ Kodak X-Omat XAR (Eastman Kodak Co., Rochester, NY). Μετά την εμφάνιση του φιλμ, έγινε ποσοτικοποίηση των επιπέδων SP-A με laser πυκνομετρία.

Ανίχνευση οξειδωμένων πρωτεϊνών στο BAL

Η ανίχνευση των οξειδωμένων πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με το OxyBlot Oxidized Protein Detection Kit (Intergen, Purchase, NY), σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως,14 μετά από ορισμένες τροποποιήσεις. Το κυτίο αυτό ανιχνεύει καρβονυλικές ομάδες τις οποίες απέκτησαν οι πρωτεΐνες με την οξείδωσή τους. Συνοπτικά, σε δείγματα BAL 25 μl προκλήθηκε αποδιάταξη των πρωτεϊνών, με προσθήκη ίσου όγκου SDS 12%. Τα παράγωγα των πρωτεϊνών προέκυψαν μετά από επώαση με 2,5 μl διαλύματος 10×2, 4-δινιτριφαινυλυδραζίνης (DNPH) επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η επώαση διεκόπη με προσθήκη 25 μl διαλύματος εξουδετέρωσης. Ακολούθησε dot blot ανάλυση των δειγμάτων, κατά την οποία τα κλάσματα που περιείχαν πρωτεΐνες παραγόμενες από DNPH αραιώθηκαν σε όγκο 500 μl με διάλυμα PBS 0,01 (pΗ 7,2) και από αυτά, κλάσματα 200 μl υποβλήθηκαν σε ανοσοαποτύπωση νιτροσελλουλόζης, όπως προηγουμένως. Η ανοσοανίχνευση των οξειδωμένων πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, αν και τα δύο αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις μειωμένες κατά 50% από τις συνιστώμενες. Εφαρμόστηκε η ίδια μέθοδος ECL για την εμφάνισή τους σε φιλμ XAR και ακολούθησε ποσοτικοποίηση με laser πυκνομετρία.

Οξειδωμένη και μη οξειδωμένη SP-A πρωτεΐνη στο BAL με τη μέθοδο Western Blot

Εν συντομία, κλάσματα 200 μl από τα δείγματα BAL συμπυκνώθηκαν με λυοφιλοποίηση και οι πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε γέλη SDS πολυακρυλαμιδίου 12,5%. Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης πραγματοποιήθηκε δύο φορές για κάθε δείγμα και οι πρωτεΐνες που απομονώθηκαν μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροσελλουλόζης (0,45 μm) για ανίχνευση του SP-A και σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Bedford, MA) για ανίχνευση του οξειδωμένου SP-A, μέσα σε ρυθμιστικό διάλυμα 25 mM Tris base, 192 mM γλυκίνης και 20% μεθανόλης. Ακολούθησε ανοσοανίχνευση του SP-A, όπως περιγράφηκε στην προηγούμενη ενότητα. Επίσης, ανιχνεύθηκε η οξειδωμένη πρωτεΐνη SP-A, με ορισμένες τροποποιήσεις σε σχέση με την προηγούμενη περιγραφή.61 Συγκεκριμένα, η μεμβράνη υπέστη αφυδάτωση για 1 λεπτό με 100% μεθανόλη και στη συνέχεια εκπλύθηκε με διάλυμα Tris 0,02 M (pΗ 7,5) με 20% μεθανόλη για 5 λεπτά και με 2 Ν υδροχλωρικού οξέος (HCl) για 5 λεπτά. Κατόπιν, επωάστηκε με 100 μg DNPH/ml σε 2 Ν HCl για 5 λεπτά. Ακολούθησαν 3 εκπλύσεις με 2 Ν HCl, 7 εκπλύσεις με 100% μεθανόλη και μια έκπλυση με 0,02 Μ TBS (διάρκεια κάθε έκπλυσης 5 λεπτά). Η μεμβράνη διατηρήθηκε σε κατάλληλο γαλακτωματοποιημένο διάλυμα 5% (powdered milk, Carnation) σε 0,02 Μ TBS και 0,05% Tween-20 για όλη τη διάρκεια της νύκτας. Όλα τα στάδια μετά τη μεταφορά των δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν σε 100 ml διαλύματος σε θερμοκρασία δωματίου. Οι οξειδωμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με την ίδια διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως.

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι αναλύσεις για το γραμμικό πρότυπο τάσης ανάμεσα στη δόση και την κύρια έκβαση, καθώς και μη παραμετροποιημένες συγκρίσεις, πραγματοποιήθηκαν με το SAS V9.1 (SAS Institute, Cary, NC) και κάθε τιμή p <0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Πριν την ανάλυση, οι δόσεις LPS μετατράπηκαν σε λογαριθμική κλίμακα, ώστε να ικανοποιείται η υπόθεση κατανομής που σχετίζεται με το γραμμικό πρότυπο. Όλα τα υπόλοιπα στοιχεία αναλύθηκαν με τη δοκιμασία t (Sigma Stat, SPSS; Chicago, IL).

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Παρατηρήσεις σχετικά με τη συμπεριφορά


Τόσο οι WT όσο και οι ΚΟ ποντικοί, οι οποίοι εκτέθηκαν στις διάφορες δόσεις LPS, διαπιστώθηκε ότι είχαν παρόμοια συμπεριφορά με αυτούς που έλαβαν φυσιολογικό ορό. Ωστόσο, οι ποντικοί που έλαβαν χαμηλή δόση LPS ακολουθούμενη από έκθεση σε όζον συμπεριφέρονταν διαφορετικά από αυτούς που εκτέθηκαν σε διηθούμενο αέρα (FA). Λίγη ώρα μετά την έναρξη της έκθεσης σε όζον, το τρίχωμα των ζώων ανορθώθηκε. Ύστερα από 30 λεπτά έως 12 ώρα, τα ποντίκια έγιναν αδρανή, κουλουριάστηκαν και φάνηκε ότι αποκοιμήθηκαν για το υπόλοιπο χρονικό διάστημα της δοκιμασίας. Μετά την έκθεση, η δραστηριότητά τους επανήλθε μέσα σε 1 ώρα. Αντίθετα, οι ποντικοί που εκτέθηκαν σε LPS και FA παρέμειναν δραστήριοι καθ’ όλη τη διάρκεια της έκθεσης.

Μελέτη ανταπόκρισης στη δόση LPS για τους ποντικούς WT

Η χορήγηση LPS και η μετέπειτα ανάλυση του BAL ανέδειξε πολλαπλές μεταβολές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου που έλαβε φυσιολογικό ορό (Εικ. 1). Αυτές περιλαμβάνουν σημαντική αύξηση (p < 0,05) στο συνολικό αριθμό κυττάρων του BAL (Εικ. 1Α), στο ποσοστό πολυμορφοπύρηνων (PMNs) (Εικ. 1Β) και στα επίπεδα της MIP-2 πρωτεΐνης (Εικ. 1C), σε κάθε τελικό σημείο για δόσεις LPS ≥0,2 ng, ≥0,5 ng και ≥1 ng, αντίστοιχα. Ο αριθμός ολικών πρωτεϊνών (Εικ. 1D) και ο βαθμός οξείδωσής τους (Εικ. 1Ε), υπολογιζόμενος από την περιεκτικότητα των ολικών οξειδωμένων πρωτεϊνών σε καρβονυλικές ομάδες, ήταν επίσης υψηλότεροι στους ποντικούς που έλαβαν LPS και μάλιστα με στατιστική σημαντικότητα (p <0,05) σε δόσεις LPS 1 ng και υψηλότερες. Τα επίπεδα του SP-A στο BAL, υπολογιζόμενα με dot blot, παρέμειναν φυσιολογικά στις περισσότερες δόσεις, ενώ μειώθηκαν και αυξήθηκαν σε δόση 0,2 και 50 ng, αντίστοιχα (Εικ. 1F). Δεν διαπιστώθηκε σταθερή μεταβολή του αριθμού των ολικών φωσφολιπιδίων σε καμία δόση LPS (δεν απεικονίζεται). Η δόση LPS (Εικ. 1A, 1B, 1C) συσχετίστηκε θετικά με τις παρατηρούμενες αυξήσεις στον αριθμό ολικών κυττάρων (r2 = 0,688, p <0,0001), στο ποσοστό PMNs (r2 = 0,689, p <0,0001)και στα επίπεδα της πρωτεΐνης ΜΙΡ-2 (r2 = 0,633, p <0,0001). Δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση με τις άλλες παραμέτρους.

ΕΙΚΟΝΑ 1. Επίδραση της LPS στον ολικό αριθμό κυττάρων και αριθμό ΡΜΝ, περιεκτικότητα σε ΜΙΡ-2, ολικές και ολικές οξειδωμένες
πρωτεΐνες και ολικό SP-A στο BAL ποντικών WT. Στους ποντικούς χορηγήθηκαν ενδοφαρυγγικά διαφορετικές συγκεντρώσεις LPS
(0,2, 0,5, 1, 2, 50, και 200 ng) σε 50 μl φυσιολογικού ορού. Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου έλαβαν παράλληλα 50 μl φυσιολογικού
ορού. Ακολούθησε συλλογή του BAL, 20 ώρες μετά τη χορήγηση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (standard
deviation, τυπική απόκλιση) για τα ολικά κύτταρα (Α), τα PMNs (Β), την ΜΙΡ-2 (C), τις ολικές πρωτεΐνες (D), τις ολικές οξειδωμένες
πρωτεΐνες (E) και τον ολικό SP-A (F). Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές (p ≤ 0,05) μεταξύ της ομάδας που έλαβε LPS (γκρι στήλες)
και της ομάδας ελέγχου (λευκή στήλη) (n = 4 για κάθε ομάδα) υποδηλώνονται με αστερίσκο (*). Στο κουτί αναγράφεται η συσχέτιση
μεταξύ της δόσης LPS και των αποτελεσμάτων.



Σύγκριση της επίδρασης της LPS στους ποντικούς WT και ΚΟ

Το BAL από ποντικούς ΚΟ, στους οποίους χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός ή LPS (0,5 ng ή 2,0 ng/ ποντικός), εμφάνισε σημεία φλεγμονής μετά από τη χορήγηση LPS (Εικ. 2). Μεταξύ των δύο ομάδων που έλαβαν LPS ή φυσιολογικό ορό διαπιστώθηκαν αρκετές διαφορές σε πολλά τελικά σημεία και για τις δύο δόσεις LPS (Εικ. 2A-2D). Οι τιμές αναφοράς για τις ολικές οξειδωμένες πρωτεΐνες (Εικ. 2Ε) και για τα ολικά φωσφολιπίδια (Εικ. 2F) διέφεραν μεταξύ τους, για το λόγο αυτό ως τιμή αναφοράς ορίστηκε το 100% και τα δείγματα LPS υπολογίστηκαν ως εκατοστιαίο ποσοστό αυτής. Τα επίπεδα οξειδωμένων πρωτεϊνών αυξήθηκαν μετά τη χορήγηση LPS και μάλιστα διαπιστώθηκε μια τάση για μεγαλύτερη αύξηση στους ποντικούς ΚΟ, η οποία ήταν στατιστικά σημαντική μόνο σε δόση 0,5 ng LPS. Τα επίπεδα των φωσφολιπιδίων μειώθηκαν και παρατηρήθηκε στατιστική σημαντικότητα στη δόση των 0,5 ng LPS για τους ποντικούς WT και στη δόση των 2 ng LPS για την ομάδα ΚΟ.

Από τη σύγκριση των στοιχείων των ομάδων ΚΟ και WT προέκυψαν οι ακόλουθες διαφορές:

1) Ο συνολικός αριθμός κυττάρων (Εικ. 2Α) διέφερε μεταξύ των δύο ομάδων στα 0,5 ng LPS, αλλά δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά στα 2 ng LPS. Η διαφορά αυτή υποδηλώνει αδυναμία των ποντικών ΚΟ να ανταποκριθούν άμεσα στα χαμηλά επίπεδα LPS, η οποία όμως εξαλείφεται μετά από μια ισχυρότερη προσβολή (όπως από 2 ng LPS). 2) Η επιστράτευση των PMNs στο BAL, υπολογιζόμενη ως ποσοστό PMNs (Εικ. 2Β) είναι σταδιακή στα ποντίκια WT, ενώ διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο δόσεων LPS, αλλά και σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Στην ομάδα ΚΟ δεν διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των 2 δόσεων LPS, αν και η συσσώρευση των PMNs ήταν αυξημένη σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Παρόμοιο πρότυπο μεταβολής με αυτό των PMNs ακολούθησε και η μείωση του ολικού αριθμού μακροφάγων/ μονοκυττάρων στις δύο ομάδες (δεν απεικονίζεται). 3) Τα επίπεδα ΜΙΡ-2 (Εικ. 2C) κάθε ομάδας, στο μεγαλύτερο μέρος της μελέτης, εμφάνιζαν παράλληλη τάση με τα επίπεδα των PMNs, με τη διαφορά ότι δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ της δόσης 0,5 ng LPS και της ομάδας ελέγχου στα ποντίκια WT. Στο σύνολό τους οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι η απάντηση των ΚΟ στα χαμηλά επίπεδα LPS είναι περιορισμένη. 4) Αναφορικά με την πρωτεΐνη BAL (Εικ. 2D), αν και δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των ποντικών WT και ΚΟ στις ολικές πρωτεΐνες, υπήρξε τάση εντονότερων μεταβολών στις ολικές οξειδωμένες πρωτεΐνες στους ποντικούς ΚΟ έναντι των WT. 5) Παρόμοια, διαπιστώθηκε μείωση των ολικών φωσφολιπιδίων (Εικ. 2F) μεταξύ της ομάδας ελέγχου και της ομάδας μελέτης, αλλά όχι μεταξύ των ποντικών WT και ΚΟ.

ΕΙΚΟΝΑ 2. Επίδραση της LPS στον ολικό αριθμό κυττάρων και αριθμό ΡΜΝ, περιεκτικότητα σε ΜΙΡ-2, ολικές και ολικές οξειδωμένες πρωτεΐνες και ολικά φωσφολιπίδια σε BAL ποντικών ΚΟ, καθώς και σύγκριση με τον τύπο WT. Στους ποντικούς εγχύθηκαν ενδοφαρυγγικά επιλεγμένες δόσεις LPS (0,5 ng και 2 ng) σε 50 μl φυσιολογικού ορού. Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου έλαβαν παράλληλα 50 μl φυσιολογικού ορού. Ακολούθησε συλλογή του BAL, 20 ώρες μετά τη χορήγηση. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή± SD. (n = 4) για τον τύπο WT (γκρι στήλες) και ΚΟ (μαύρες στήλες). Στις περιπτώσεις που δεν υπάρχουν διαφορές μεταξύ των τύπων WT και ΚΟ (διαγράμματα A, B, C, D), αναφέρονται οι τιμές αναφοράς της ομάδας FA στη λευκή στήλη. Στα διαγράμματα E και F, όπου παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των δύο τύπων ποντικών, ως τιμή αναφοράς θεωρήθηκε το 100% (στικτή γραμμή). Τα στοιχεία αναφέρονται σε ολικά κύτταρα (Α), ποσοστό PMNs (Β), ΜΙΡ-2 (C), ολικές πρωτεΐνες (D), ολικές οξειδωμένες πρωτεΐνες (E) και ολικά φωσφολιπίδια (F). Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές (p ≤ 0,05) μεταξύ της ομάδας που έλαβε LPS και της ομάδας ελέγχου υποδηλώνονται με αστερίσκο (*), ενώ μεταξύ των τύπων WT και ΚΟ υποδηλώνονται με το σύμβολο (#). Οι διαφορές ανάμεσα στις δόσεις LPS στους ποντικούς WT ή ΚΟ αντιπροσωπεύονται με μια συνδετική γραμμή, πάνω από την οποία αναγράφεται η τιμή p.



Επίδραση του όζοντος ή του FA στα κύτταρα του BAL και στις κυτταροκίνες σε ποντικούς WT και ΚΟ που έλαβαν LPS

Η έκθεση των ποντικών WT σε LPS (2 ng) + όζον είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές αυξήσεις (p < 0,05) σε πολλές παραμέτρους (Εικ. 3), σε σύγκριση με την έκθεση σε LPS + FA. Αυτές περιλαμβάνουν σημαντικές μεταβολές του ολικού αριθμού κυττάρων (Εικ. 3Α), των επιπέδων ΜΙΡ-2 (Εικ. 3C) και MCP-1 (δεν απεικονίζεται), των ολικών πρωτεϊνών (Εικ. 3D) και των ολικών οξειδωμένων πρωτεϊνών (Εικ. 3E) στα δείγματα BAL. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων στο ποσοστό ΡΜΝ (Εικ. 3Β) ή στα φωσφολιπίδια (Εικ. 3F).

Η έκθεση των ποντικών ΚΟ σε LPS (2 ng) + όζον προκάλεσε, σε σύγκριση με την ομάδα που έλαβε LPS + FA, σημαντικές αυξήσεις (p <0,05) στα επίπεδα των ΜΙΡ-2 (Εικ. 3C) και MCP-1 (δεν απεικονίζεται), των φωσφολιπιδίων (Εικ. 3F), των ολικών πρωτεϊνών (Εικ. 3D) και των οξειδωμένων πρωτεϊνών (Εικ. 3E). Το πρότυπο απάντησης στην LPS ήταν παρόμοιο με το παρατηρούμενο στους ποντικούς WT, με εξαίρεση τη σημαντική αύξηση των φωσφολιπιδίων στην ομάδα ΚΟ μετά από χορήγηση LPS + όζοντος, χωρίς μεταβολή του ολικού αριθμού κυττάρων, συγκριτικά με την έκθεση σε LPS + FA.

Ωστόσο, σημαντικές αλλαγές διαπιστώθηκαν μεταξύ των ποντικών WT και ΚΟ μετά από έκθεση σε LPS + όζον ως προς το ποσοστό ΡΜΝ (Εικ. 3Β), ΜΙΡ-2 (Εικ. 3C) και φωσφολιπιδίων (Εικ. 3F). Δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές μεταξύ των δύο τύπων ποντικών στα επίπεδα MCP-1 (δεν απεικονίζεται), ολικών πρωτεϊνών (Εικ. 3D) και ολικών οξειδωμένων πρωτεϊνών (Εικ. 3E). Μετά την έκθεση σε LPS + FA, διαφορές μεταξύ των ποντικών WT και ΚΟ παρατηρήθηκαν μόνο στον ολικό αριθμό κυττάρων (Εικ. 3Α).

ΕΙΚΟΝΑ 3. Επίδραση της έκθεσης σε LPS + FA ή σε LPS + όζον στον ολικό αριθμό κυττάρων και αριθμό PMNs, ΜΙΡ-2, φωσφολιπίδια, ολικές και ολικές οξειδωμένες πρωτεΐνες, σε BAL ποντικών ΚΟ και WT. Οι ποντικοί έλαβαν ενδοφαρυγγικά 2 ng LPS σε 50 μl φυσιολογικού ορού και 13 ώρες αργότερα εκτέθηκαν σε FA ή όζον (2 ppm για 3 ώρες). Το BAL συλλέχθηκε 4 ώρες μετά το τέλος της έκθεσης, ή συνολικά 20 ώρες μετά τη χορήγηση LPS. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (n = 4) για την ομάδα LPS +FA (ανοιχτές στήλες) και LPS + όζον (μαύρες στήλες). Τα στοιχεία αναφέρονται σε ολικά κύτταρα (Α), ποσοστό PMNs (Β), ΜΙΡ-2 (C). Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές (p ≤0,05) μεταξύ της ομάδας LPS + FA και της ομάδας LPS + όζον υποδηλώνονται με αστερίσκο(*), ενώ μεταξύ των τύπων WT και ΚΟ υποδηλώνονται με το σύμβολο (#) (p ≤0,05).



Επίδραση της έκθεσης σε LPS και όζον στα επίπεδα SP-A και οξειδωμένου SP-A

Μετά από έκθεση σε LPS + FA παρατηρήθηκε μικρή αλλά σημαντική αύξηση της ολικής περιεκτικότητας SP-A, σε σύγκριση με την έκθεση μόνο σε FA (Εικ. 4Α). Παρόμοιες αυξήσεις παρατηρήθηκαν μετά από το συνδυασμό LPS + όζοντος συγκριτικά με μόνο όζον, υποδηλώνοντας πως ο υπεύθυνος παράγοντας για την αύξηση αυτή είναι η LPS. Η ανάλυση των επιπέδων οξειδωμένου SP-A αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στη διμερή μορφή του SP-A μετά από έκθεση σε όζον και σε LPS + όζον (Εικ. 4Β). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της χορήγησης LPS + FA και μόνο FA, υποδηλώνοντας ότι οι μεταβολές στην οξείδωση του SP-A οφείλονται κύρια στην έκθεση στο όζον.

ΕΙΚΟΝΑ 4. Επίδραση της έκθεσης σε LPS ± όζον, σε όζον, ή μόνο σε FA, στα επίπεδα του SP-A (Διάγραμμα Α) και οξειδωμένου SP-A (Διάγραμμα Β) σε BAL ποντικών WT. Οι ποντικοί ενδοφαρυγγικά έλαβαν 2 ng LPS σε 50 μl φυσιολογικού ορού και 13 ώρες αργότερα εκτέθηκαν είτε σε FA (γκρι στήλες) ή σε όζον (μαύρες στήλες) (2 ppm για 3 ώρες). Το BAL συλλέχθηκε 4 ώρες μετά την έκθεση ή 20 ώρες μετά τη χορήγηση LPS. Συμπυκνωμένα δείγματα BAL 200 μl υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση γέλης SDS και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες, όπως περιγράφεται στην ενότητα “Μέθοδοι”. Τα επίπεδα SP-A (Διάγραμμα Α, κορυφή) και οξειδωμένου SP-A (Διάγραμμα Β, κορυφή) προσδιορίστηκαν με πυκνομετρία Western blot. n = 6 για κάθε ομάδα, εκτός από την ομάδα FA, όπου n = 5. Κάτω από τα διαγράμματα απεικονίζεται η αντιπροσωπευτική ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών (Διάγραμμα Α) και οξειδωμένων πρωτεϊνών (Διάγραμμα Β). Η στήλη αναφοράς αποτελείται από σημασμένο ανθρώπινο κυψελιδικό SP-A (hSP-A) με ζώνες μονομερών (Μ) και διμερών (D) SP-A. Η θέση των επιπέδων διμερών οξειδωμένων SP-A καθορίστηκε μετά από σύγκριση με πανομοιότυπο ανοσοαποτύπωμα με αντιορό του SP-A. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές (p ≤ 0,05) μεταξύ της ομάδας LPS + FA και της ομάδας LPS + όζον υποδηλώνονται με το σύμβολο (#), ενώ οι υπόλοιπες συγκρίσεις με έναν αστερίσκο (*).



ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Πρόσφατα, αναφέραμε14 ότι το BAL από ποντικούς WT και ΚΟ με όμοιο γενετικό υπόβαθρο παρουσιάζει σημεία φλεγμονής μετά από έκθεση σε όζον (2 ppm) για 3 ή 6 ώρες. Στον τύπο ΚΟ, πολλές παράμετροι της φλεγμονώδους απάντησης ήταν λιγότερο έκδηλες, γεγονός το οποίο αποδόθηκε στην απουσία SP-A από το κυψελιδικό μακροφάγο, η οποία το καθιστά λιγότερο ικανό να πυροδοτήσει μια αποτελεσματική φλεγμονώδη απάντηση. Επιπλέον, μια άλλη ομάδα ερευνητών αναφέρει ότι η εισπνοή μεγάλης δόσης LPS (100 μg) πριν από έκθεση των ποντικών WT σε όζον φάνηκε ότι ευαισθητοποίησε διαφορετικά τα πειραματόζωα στο όζον στις διάφορες ηλικίες, σε επίπεδο δεικτών φλεγμονής.8 Στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε την υπόθεση ότι οι χαμηλές δόσεις LPS επιδρούν αρνητικά στις φλεγμονώδεις διαδικασίες του πνεύμονα και διαφοροποιούν την επαγόμενη από όζον βλάβη σε ποντικούς με ακέραιη φυσική ανοσία (δηλαδή τύπου WT) και σε ποντικούς με διαταραγμένη φυσική ανοσία (δηλαδή τύπου ΚΟ).

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι: 1) η χαμηλή δόση LPS (2 ng) μεταβάλλει την περιεκτικότητα του BAL σε κύτταρα, κυτταροκίνες, ολικές πρωτεΐνες και οξειδωμένες πρωτεΐνες, σε ποντικούς WT 20 ώρες μετά από χορήγηση LPS. 2) παρατηρούνται διαφορές μεταξύ των τύπων WT και ΚΟ μετά από χορήγηση LPS (0,5 ή 2 ng) στον ολικό αριθμό κυττάρων και στο πρότυπο απάντησης της ΜΙΡ-2, καθώς και στα βασικά επίπεδα οξειδωμένων πρωτεϊνών και φωσφολιπιδίων. 3) αν 13 ώρες μετά τη χορήγηση LPS (2 ng) ακολουθήσει 3ωρη έκθεση σε όζον, παρατηρούνται διαφορές ανάμεσα στους ποντικούς WT και ΚΟ ως προς τα ΡΜΝ, ΜΙΡ-2 και φωσφολιπίδια. 4) στον τύπο WT παρατηρείται αύξηση του ολικού SP-A μετά από έκθεση σε LPS + FA ή LPS + όζον, αλλά όχι σε απάντηση μόνο σε όζον. Επίσης, παρατηρήθηκε αύξηση των διμερών οξειδωμένων SP-A μετά από έκθεση σε όζον ή LPS + όζον, αλλά όχι σε LPS + FA. 5) Η χορήγηση LPS δεν έχει εμφανή επίδραση στη συμπεριφορά, ενώ στην πορεία της έκθεσης σε όζον και οι δύο τύποι ποντικών εμφανίζονται λιγότερο δραστήριοι. Τα ευρήματα αυτά στο σύνολό τους μας επιτρέπουν τις ακόλουθες υποθέσεις: 1) Η επαφή με χαμηλή δόση LPS μπορεί να έχει μακροπρόθεσμες επιδράσεις στη σύσταση του BAL. 2) Ένα δεύτερο ερέθισμα μπορεί να οδηγήσει σε απρόβλεπτα ευρήματα, συγκριτικά με κάθε ερέθισμα μόνο του, και 3) Ο SP-A έχει κάποιο ρόλο στη ρύθμιση της φλεγμονής.

Oι διαφορές μεταξύ των ποντικών WT και ΚΟ σε απάντηση στην LPS είναι μακροπρόθεσμες, καθώς είναι ανιχνεύσιμες 20 ώρες μετά τη χορήγηση LPS και περιορίζονται στον ολικό αριθμό κυττάρων στο BAL και στο πρότυπο της απάντησης της ΜΙΡ-2. Αν και είναι αδιευκρίνιστος ο λόγος, με βάση τα ευρήματα αυτά υποστηρίζεται η θεωρία ότι, στον τύπο WT, τα κυψελιδικά κύτταρα και πιθανότατα και τα μακροφάγα μπορούν, ενόψει μιας ασθενούς απειλής (π.χ. 0,5 ng LPS), να επάγουν τη συσσώρευση σημαντικού αριθμού κυττάρων στον κυψελιδικό χώρο, μέσω μικρών και ασήμαντων μεταβολών της έκφρασης της ΜΙΡ-2. Αντίθετα, το ερέθισμα είναι ισχυρότερο, όπως στην περίπτωση των 2 ng LPS, για τη συσσώρευση αρκετού αριθμού κυττάρων είναι απαραίτητη η αύξηση μορίων όπως της ΜΙΡ-2, δηλ. ενός χημειοτακτικού παράγοντα των ουδετεροφίλων παραγόμενου από τα μακροφάγα. Ωστόσο, τα κυψελιδικά κύτταρα έχουν διαταραγμένη πρώτη γραμμή άμυνας, όπως πιθανότατα ισχύει στα ποντίκια ΚΟ, μια ήπια απειλή (0,5 ng LPS) γίνεται αντιληπτή ως μεγαλύτερη (δηλαδή 2 ng LPS), με αποτέλεσμα την αύξηση μορίων όπως της ΜΙΡ-2. Επιπλέον, η αυξημένη παραγωγή ΜΙΡ-2 στους ποντικούς ΚΟ, σε απάντηση σε ένα ήπιο ερέθισμα, κατέστη αδύνατο να οδηγήσει σε αύξηση των ολικών κυττάρων στον κυψελιδικό χώρο, όπως συμβαίνει στα WT ποντίκια, στα οποία η απάντηση θεωρείται αρκετή για την εξάλειψη της δυνητικής απειλής. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις συμφωνούν στο σύνολό τους με την άποψη ότι οι ποντικοί ΚΟ εκφράζουν διαταραγμένη ή και περιορισμένη απάντηση, σε σύγκριση με τους WT. Είναι πιθανό ότι το κυψελιδικό μακροφάγο του ποντικού ΚΟ, αντίθετα με αυτό του WT, δεν είναι επαρκώς προετοιμασμένο για την αποτελεσματική απάντηση στην LPS. Παλαιότερα υποθέσαμε ότι το κυψελιδικό μακροφάγο, σε απουσία SP-A, εκδηλώνει μειωμένη δραστικότητα επειδή δεν πληρούται από τον SP-A.18 Πρόσφατα, διαπιστώθηκε ανεπαρκής φαγοκυττάρωση της K. Pneumonia27 από τα ΚΟ κυψελιδικά μακροφάγα, συγκριτικά με του WT, σε πολλές μελέτες με SP-A ΚΟ ποντικούς. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν SP-A ΚΟ ποντικοί ως προς την αδυναμία αντιμετώπισης λοιμώξεων από P. Aeruginosa32 και από streptococcus Β,63 καθώς και την ικανότητα της πρωτεΐνης SP-A να επάγει τη φλεγμονή και να ελαχιστοποιεί την πνευμονική βλάβη και τη θνητότητα μετά από πειραματική μεταμόσχευση μυελού των οστών.64,65

Όταν οι ποντικοί που έλαβαν LPS εκτέθηκαν και σε δεύτερο βλαπτικό ερέθισμα (δηλ. στο όζον), παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των PMNs και της πρωτεΐνης ΜΙΡ-2 στον τύπο ΚΟ, συγκριτικά με τον WT, μολονότι και στους δύο τύπους σημειώθηκε σημαντική αύξηση της ΜΙΡ-2 σε σχέση με την ομάδα που έλαβε LPS + FA. Αντίθετα, όταν και οι τύποι ΚΟ και WT εκτέθηκαν σε ένα μόνο ερέθισμα, είτε LPS (2 ng) είτε όζον,14 δεν διαπιστώθηκαν διαφορές στα επίπεδα ΜΙΡ-2 ή PMNs (μόνο στην ομάδα της LPS), αν και ήταν αυξημένα σε σχέση με τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου, στις οποίες δεν επέδρασε κανένα ερέθισμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε προηγούμενη μελέτη μας,14 αν και δεν διαπιστώθηκε διαφορά στην πρωτεΐνη ΜΙΡ-2 μεταξύ των τύπων WT και ΚΟ μετά από έκθεση σε όζον, η περιεκτικότητα του ΜΙΡ-2 mRNA ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ποντικούς ΚΟ. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις οδηγούν στην υπόθεση ότι η προηγηθείσα επαφή με LPS αυξάνει την έκφραση της ΜΙΡ-2 μέσω μεταφραστικών ρυθμίσεων. Από την άλλη πλευρά, η έκθεση του ΚΟ ποντικού σε όζον μπορεί να επιδράσει αρνητικά σε μεταμεταγραφικές διαδικασίες που σχετίζονται με την έκφραση της ΜΙΡ-2. Αυτές οι πιθανότητες είναι δυνατό να ερμηνεύσουν τα χαμηλότερα επίπεδα ΜΙΡ-2 που παρατηρούνται σε απάντηση στην έκθεση σε LPS + όζον στον ΚΟ τύπο, σε σχέση με τον WT, υποστηρίζοντας τη συμμετοχή του SP-A στη ρύθμιση της ΜΙΡ-2.

Επιπρόσθετα, σύμφωνα με την παλαιότερη μελέτη μας,14 η μετάφραση της ΜΙΡ-2 είναι δυνατό να ανασταλεί πλήρως στον ποντικό ΚΟ μετά από έκθεση σε όζον, όπως εκτιμάται από τη διαπίστωση ίσης περιεκτικότητας mRNA στους ποντικούς που εκτέθηκαν σε όζον και στους ΚΟ ποντικούς. Ακόμα, η LPS ή το όζον είναι πιθανό να επιδρούν στην παραγωγή της ΜΙΡ-2 με διαφορετικούς ή αλληλοεπικαλυπτόμενους μηχανισμούς. Συγκεκριμένα, στον τύπο WT, η μεταβολή των επιπέδων ΜΙΡ-2 μετά από συνδυασμένη έκθεση (σε LPS + όζον) ήταν μεγαλύτερη από το άθροισμα των μεταβολών κάθε μεμονωμένου παράγοντα (μόνο LPS ή όζον). Οι τιμές ΜΙΡ-2 ήταν 36 pg/ml ± 16 για την ομάδα ελέγχου, 148 pg/ml ± 38 για την ομάδα που έλαβε LPS και 627 pg/ml ± 205 για την ομάδα που εκτέθηκε σε όζον (χωρίς προηγούμενη επαφή με LPS).14 Παρόλα αυτά, μετά από έκθεση σε συνδυασμό LPS και όζον, τα επίπεδα ΜΙΡ-2 έφτασαν τα 1.234 pg/ml ± 277, αυξάνοντας την πιθανότητα συνέργειας των δύο παραγόντων. Στον ποντικό ΚΟ φαίνεται ότι υπάρχει περιορισμένη συνέργεια, υποδηλώνοντας ότι ο SP-A συμμετέχει στη ρύθμιση της φλεγμονής και ιδ

© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE