Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
RNA interference: Διαγνωστικό εργαλείο ή θεραπευτική τεχνική;
Με τον όρο “RNA παρέμβαση” (RNA interference-RNAi) αναφερόμαστε σε έναν θεμελιώδη βιολογικό μηχανισμό κυτταρικής ρύθμισης της γονιδιακής σίγασης μετα-μεταγραφικά. Η εκκίνηση του γίνεται από πρόδρομα δίκλωνα μόρια RNA (double-stranded RNA-dsRNA) των οποίων το μέγεθος και η προέλευση ποικίλει. Τα μόρια αυτά αρχικά εξελίσσονται ταχύτατα σε μικρά δίκλωνα μόρια RNA με μήκος περίπου από 21 έως 28 νουκλεοτίδια. Στη συνέχεια συμμετέχουν στην αναγνώριση των συμπληρωματικών τους μονόκλωνων μορίων RNA και οδηγούν είτε στη διάσπαση ή τη μεταφραστική καταστολή των τελευταίων. Στους στόχους του μηχανισμού της RNAi συμπεριλαμβάνονται RNAs ιών και μεταθετών στοιχείων (με ιδιαίτερη σημασία για κάποιες μορφές έμφυτης ανοσολογικής αντίδρασης), καθώς και μόρια RNA με ρυθμιστικό ρόλο στην ανάπτυξη, και στην τροποποίηση της δομής της χρωματίνης, συμβάλλοντας έτσι στην ακεραιότητα του γονιδιώματος1.

Μικρα RNAs

Ρόλο κλειδί στη διαδικασία της RNAi έχουν οι μονόκλωνες αλυσίδες των "μορίων RNAs σύντομης παρέμβασης" (short-interference RNA-siRNA) που έχουν συμπληρωματική νουκλεοτιδική αλληλουχία με τις αλυσίδες των mRNA στόχων τους. Τα siRNAs κατευθύνουν εξειδικευμένες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην οδό της RNAi στο στοχευόμενο αγγελιοφόρο μόριο RNA (messenger RNA-mRNA). Συνέπεια αυτού είναι η διάσπαση του στοχευόμενου mRNA σε μικρότερα κομμάτια τα οποία δεν μπορούν πλέον να μεταφραστούν σε λειτουργικό πολυπεπτίδιο. Ένα άλλο είδος μικρού ρυθμιστικού RNA που προκύπτει από τον ίδιο μηχανισμό της RNAi είναι το μικρομόριο RNA (micro RNA-miRNA) το οποίο, όμως, μεταγράφεται από το γονιδίωμα του κυττάρου και καταστέλλει τη μετάφραση του στοχευόμενου mRNA. Στα θηλαστικά, έχουν χαρακτηριστεί ως τώρα τρεις μεγάλες ομάδες μικρών ρυθμιστικών RNAs: τα μικρομόρια RNAs (miRNAs), τα σύντομης παρέμβασης μόρια RNAs (siRNAs) και τα piwi-συσχετιζόμενα RNAs (piwi-associated RNAs-piRNAs). Τα μόρια-πρόδρομοι των miRNAs και piRNAs είναι ενδογενή κωδικοποιημένα πρώιμα μετάγραφα RNA. Τα siRNAs παράγονται από τη διάσπαση εξωγενών dsRNAs2.

Η ΟΔΟΣ της RNAi

Ο μηχανισμός της RNAi είναι μια διαδικασία γονιδιακής σίγασης, άμεσα εξαρτώμενη από μόρια RNAs. Σημαίνοντα ρυθμιστικό ρόλο στην οδό της RNAi έχει το πρωτεϊνικό σύμπλοκο σίγασης πού επάγεται από τα μόρια RNAs, και αναφέρεται με τον όρο RISC (RNA-induced silensing complex-RISC). Το έναυσμα για τη συναρμολόγηση του RISC είναι τα μικρά δίκλωνα μόρια RNAs που έχουν δημιουργηθεί στο κυτταρόπλασμα. Αυτά, αλληλεπιδρούν με ένα από τα καταλυτικά συστατικά του RISC που είναι ειδικές πρωτεΐνες οι οποίες ανήκουν στην οικογένεια Argonaute. Όλα τα μικρά ρυθμιστικά μόρια RNA, ανεξάρτητα από τις διαφορές στο μέγεθος ή στην βιογένεση τους, καταλύονται στην οδό της RNAi, από τα μέλη της πρωτεϊνικής οικογένειας Argonaute (ΑGΟ). Οι πρωτεΐνες αυτές συνιστούν μια καλά διατηρημένη οικογένεια, της οποίας τα μέλη φαίνεται να συμμετέχουν στον μηχανισμό της RNAi ή σε άλλα παρόμοια φαινόμενα. Πέρα από τον σημαντικό τους ρόλο σε αυτούς τους μηχανισμούς, οι πρωτεΐνες Argonaute έχουν ρυθμιστικό ρόλο στην ανάπτυξη, και τουλάχιστον μια υποομάδα της οικογένειας συμμετέχει στον καθορισμό της τελικής έκβασης των βλαστικών κυττάρων3.

Στα πρώτα στάδια έναρξης της οδού της RNAi, συμμετέχει το ένζυμο Dicer, το οποίο καταλύει τη διάσπαση μεγάλων δίκλωνων dsRNAs σε μικρά κομμάτια μήκους 20-25 ζευγαριών βάσεων (base pair-bp). Η μία αλυσίδα από τις δύο κάθε δίκλωνου κομματιού RNA συνιστά τον κλώνο-οδηγό (guide strand), και είναι αυτή που θα ενσωματωθεί στο RISC και θα συνδυαστεί με τη συμπληρωματική της αλληλουχία. Πιο συγκεκριμένα, στο πρωταρχικό στάδιο, εξωγενές dsRNA (π.χ. ιϊκό) καταλύεται σε siRNAs από το ένζυμο Dicer, μέλος της οικογένειας των RNAασων III που είναι ριβονουκλεάσες εξειδικευμένες στην κατάλυση dsRNAs. Στη συνέχεια, ο αντίστροφος κλώνος (antisense strand) του siRNA ενσωματώνεται στο RISC. Στο μετέπειτα στάδιο, το πρωτεϊνικό σύμπλοκο RISC στοχεύει και καταλύει το mRNA που είναι συμπληρωματικό του siRNA που είναι ήδη δεσμευμένο στο RISC. Έτσι επιτυγχάνεται η αναστολή της μετάφρασης του mRNA-στόχου (Εικόνα 1Α). Στα θηλαστικά κύτταρα η επαγωγή του μηχανισμού της RNAi πυροδοτείται και από ενδογενή micro-RNA αντίγραφα (pri-miRNA) που καταλύονται από την πολυμεράση ΙΙ (Pol II) με μήκος 21-23 bp. Τα μόρια αυτά κατευθύνουν την αποδόμηση του συγγενούς τους mRNA, αναστέλλοντας έτσι την παραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης4. Πιο συγκεκριμένα, πρόδρομα miRNA προσδένονται στο κυτταρόπλασμα διάμεσου του Dicer και AGO2-RISC σύμπλοκου, αναγνωρίζοντας τις περιοχές στόχου στο mRNA αναστέλλοντας έτσι την παραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης (Εικόνα 1Β).

Τα siRNA μπορούν να συντεθούν και χημικά είτε να εκφραστούν από έναν φορέα DNA. Στη δεύτερη περίπτωση, κατασκευάζεται ένα ένθετο DNA μήκους περίπου 70 bp που κωδικοποιεί ένα μικρό RNA με αλληλουχία φουρκέτας (short hairpin RNA-shRNA), τέτοιο ώστε να στοχεύει κατάλληλα το επιθυμητό γονίδιο. Το ένθετο κλωνοποιείται σε έναν φορέα έκφρασης. Όταν ένα κύτταρο δια-μολυνθεί με αυτό το σύμπλοκο (insert-containing vector), εκφράζει το shRNA, το οποίο διασπάται αμέσως από τον κυτταρικό μηχανισμό σε dsRNAs μήκους 19-22 bp5.

Βιολογικες Εφαρμογες

Η ικανότητα της RNAi να επιφέρει εξειδικευμένη παροδική παρέμβαση στην γονιδιακή έκφραση ανάλογη της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας, ανοίγει τους ορίζοντες για μια νέα τάξη μορίων με βάση τα νουκλεϊκά οξέα. Η αξιοποίηση της μεθόδου σε ιατρικές εφαρμογές φαίνεται να κερδίζει συνεχώς έδαφος, αφού η RNAi έχει θεωρηθεί ως η πιο σημαντική πρόσφατη ανακάλυψη στο χώρο της βιολογίας6.

Το πρώτο βήμα για τον προσδιορισμό υποψήφιων siRNΑ στόχων, ξεκινά συνήθως με τον σχεδιασμό και τη σύνθεση siRNA με τη βοήθεια της βιοπληροφορικής. Επόμενη κίνηση είναι ο in vitro χαρακτηρισμός των υποψήφιων siRNΑs, της δραστικότητας και της ειδικότητας τους, που μπορεί να οδηγήσει τελικά στην επιλογή των καταλληλότερων siRNΑ για πιθανούς φαρμακευτικούς στόχους. Στο σημείο αυτό, είναι σημαντικό να ληφθούν υπόψη δύο παράμετροι, που σχετίζονται με την εξειδίκευση των siRNΑs, και αυτοί είναι: 1) η σίγαση μη επιθυμητών γονιδίων (off-targeting silencing) εξαιτίας της μερικής ομολογίας αυτών των γονιδίων με το siRNΑ, και 2) η ανοσολογική διέγερση (immune stimulation), εξαιτίας της εμπλοκής του ανοσοποιητικού συστήματος με το μόριο του siRNΑ7.

Το επόμενο βήμα, μετά τον προσδιορισμό και επιλογή των βέλτιστων για φαρμακευτική χρήση siRNΑ, είναι η επιτυχής μεταφορά τους στα κύτταρα στόχους. Όμως, υπάρχουν δύο τουλάχιστον προκλήσεις που πρέπει να ληφθούν υπόψη για την ανάπτυξη φαρμάκων που βασίζονται στον μηχανισμό της RNAi: Πρώτον, όπως, έχει ήδη αναφερθεί η γονιδιακή σίγαση από την οδό της RNAi λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα, όπου το RISC κατευθύνει το siRNΑ που έχει δεσμεύσει στο αντίστοιχο mRNA-στόχο. Συνεπώς, κάθε μέθοδος μεταφοράς κάποιου siRNΑ με θεραπευτικές ιδιότητες πρέπει να είναι εξειδικευμένη να απελευθερώνει το siRNΑ μόνο στο κυτταρόπλασμα των σχετικών κυττάρων σε ενεργή μορφή. Δεύτερον, ο μηχανισμός που οδηγεί στην κατάλυση και διάσπαση του mRNA δεν συμπεριλαμβάνει και την αποδόμηση του αντίστροφου (antisense) κλώνου του siRNΑ. Επομένως, το siRNΑ συνεχίζει να δρα καταλυτικά, και έτσι η σίγαση του γονιδίου στόχου παραμένει για σημαντικό χρονικό διάστημα.

Image 1

Εικόνα 1. Το μονοπάτι της RNA interference (RNAi) αφορά είτε στα small interfering RNA (siRNA) είτε στα micro-RNA (miRNA). A. Eξωγενές δίκλωνο dsRNA (π.χ. ιϊκό) καταλύεται σε siRNAs από το ένζυμο Dicer, μέλος της οικογένειας των RNAασων III που είναι ριβονουκλεάσες εξειδικευμένες στην κατάλυση dsRNAs. Στη συνέχεια, ο αντίστροφος κλώνος (antisense strand) του siRNA ενσωματώνεται με τις πρωτεΐνες AGO2 στο RISC. Το ενεργοποιημένο πρωτεϊνικό σύμπλοκο RISC στοχεύει και καταλύει το mRNA που είναι συμπληρωματικό του siRNA και που είναι ήδη δεσμευμένο στο RISC. Έτσι επιτυγχάνεται η αναστολή της μετάφρασης του mRNA-στόχου. B. Η επαγωγή του μηχανισμού της RNAi πυροδοτείται και από ενδογενή micro-RNA αντίγραφα (pri-miRNA) που καταλύονται από την πολυμεράση ΙΙ (Pol II) με μήκος 21-23 bp. Πρόδρομα miRNA προσδένονται στο κυτταρόπλασμα διάμεσου του Dicer και AGO2-RISC σύμπλοκου, αναγνωρίζοντας τις περιοχές στόχου στο mRNA αναστέλλοντας έτσι την παραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης. Modified from de Fougerolles A & Novobrantseva T, Curr Opin Pharm 200816.

Αρκετοί τρόποι μεταφοράς του siRNΑ βρίσκονται υπό έρευνα. Ανάμεσα σε αυτούς περιλαμβάνονται η άμεση μεταφορά siRNΑ μέσα σε φυσιολογικό ορό, η ενθυλάκωση του σε λιποσώματα (liposomes) και λιποπλέγματα (lipoplexes), η σύζευξη του με αντισώματα, πεπτίδια, απταμερή (aptamers) ή άλλα μόρια, και επίσης ο σχηματισμός συμπλόκων με χημικά και βιολογικά πολυμερή. Κάθε είδος μεταφοράς έχει τα προτερήματα της αλλά και συγκεκριμένες προκλήσεις8.

siRNΑ και Πνευμονας

Όπως και σε κάθε άλλο νουκλεϊκό οξύ, έτσι και στην ιδιαίτερη περίπτωση της μεταφοράς του siRNΑ στον πνεύμονα οι πιθανοί εξωκυτταρικοί περιορισμοί για την μεταφορά εξαρτώνται από τον τρόπο που γίνεται η χορήγηση. Η είσοδος των συμπλόκων siRNΑ στον πνεύμονα μπορεί να επιτευχθεί, ενδορινικά, ενδοτραχειακά ή δια της συστηματικής οδού8. Οι δύο πρώτοι τρόποι μεταφοράς είναι ιδιαίτερα ελκυστικοί καθότι προσφέρουν μια μοναδική ευκαιρία για εξειδικευμένη μεταφορά του siRNΑ στους αεραγωγούς και στο κυψελιδικό επιθήλιο. Εντούτοις, η κατευθυνόμενη μεταφορά νουκλεϊκών οξέων από την αναπνευστική οδό δεν είναι απλή γιατί ο πνεύμονας έχει αναπτύξει τόσο φυσικούς όσο και ανοσολογικούς φραγμούς, οι οποίοι μπορούν να παρεμποδίσουν την αποτελεσματική μεταγωγή των επιθηλιακών κυττάρων. Εκτός από τα φυσιολογικά φαινόμενα όπως η κυματοειδής κίνηση των κροσσών και η παγίδευση σωματιδίων από τη βλέννα, είναι δυνατή και η αλληλεπίδραση των συμπλόκων με το υγρό που απαλείφει τα επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών (Airway Surface Liquid-ASL). Το ASL περιέχει συστατικά αρνητικά φορτισμένα τα οποία μπορούν άμεσα να δεσμεύσουν τα θετικά φορτισμένα σύμπλοκα. Η αλληλεπίδραση αυτή μπορεί να αλλάξει στα σύμπλοκα τόσο το μέγεθος, όσο και το φορτίο τους σε αρνητικό, επιδρώντας έτσι στη διάχυση τους στα κύτταρα που στοχεύουν ή στην πρόσληψη τους από αυτά τα κύτταρα. Επιπλέον, η δέσμευση των συμπλόκων πάνω στα αρνητικά φορτισμένα συστατικά του ASL, ενδέχεται να εκτοπίσει το νουκλεϊκό οξύ από το σύμπλοκο, και συνεπώς να υποβαθμίσει την αποδοτικότητα της μεταφοράς8,9.

Δεδομένων των προαναφερθέντων δυσκολιών, έχει επιχειρηθεί η χορήγηση δια της συστηματικής οδού ως εναλλακτική της ενδορινικής ή ενδοτραχειακής οδού. Η μελέτη της μεταφοράς συμπλόκων DNA μέσω αίματος μπορεί να δώσει πληροφορίες και για τη μεταφορά συμπλόκων siRNΑ ένεκα της ομοιότητας των δύο αυτών μορίων. Η βιοδιασπορά των συμπλόκων DNA είναι αρκετά πολύπλοκη διαδικασία, που εξαρτάται από τις κολλοειδείς ιδιότητες του συμπλόκου, αλλά και από τις αλληλεπιδράσεις του με τα συστατικά του αίματος. Επιπρόσθετα, τα κύτταρα εκκαθαριστές (scavenger cells) απορροφούν συνήθως τα σύμπλοκα που φέρουν ισχυρό ανιονικό φορτίο, συμβάλλοντας έτσι στην αποβολή γενετικού υλικού από το σώμα. Ακόμα, ένα ισχυρό θετικό φορτίο πάνω στα σύμπλοκα μπορεί να είναι επιζήμιο. Στην περίπτωση μελέτης διαγονιδιακής έκφρασης έπειτα από συστηματική χορήγηση πλασμιδιακού DNA πολυκατιονικών συμπλόκων, παρατηρείται έκφραση αρχικά στους πνεύμονες και σε μικρότερη ένταση σε άλλα κύρια όργανα όπως ο σπλήνας, το συκώτι και η καρδιά. Αξιοσημείωτο είναι ότι η διαγονιδιακή έκφραση μεταβάλλεται σημαντικά όταν το πλασμιδιακό DNA ενθηλακώνεται σε πολυκατιόντα ενωμένα με υδροφιλικά πολυμερή, όπως το Pluronic. Τότε, η έκφραση του γονιδίου αναφοράς που φέρει το πλασμιδιακό DNA, είναι όμοια κατανεμημένη στα προαναφερθέντα όργανα. Παρεμφερή με αυτή την περίπτωση του DNA είναι και η ενδοφλέβια ένεση συμπλόκου siRNΑ με λιποσώματα που περιέχουν PEG. Αναφέρεται ότι τα σύμπλοκα αυτά μεταφέρουν siRNΑ κατά προτίμηση στα κύτταρα του συκωτιού, το οποίο είναι ένδειξη ότι οι ιδιότητες της επιφάνειας των πολυπλεγμάτων είναι σημαντικός παράγοντας που υπαγορεύει την in vivo διασπορά τους9.

Ένας από τους φαρμακευτικούς στόχους των συνθετικών siRNΑs θα μπορούσαν να είναι ιοί. Η τοπική εφαρμογή της RNΑi αναφέρεται να προσφέρει προστασία από αναπνευστικές ιϊκές λοιμώξεις συμπεριλαμβανομένων των RSV10, PIV10, SARS-SCV11 και τον ιό της γρίπης (influenza)12,13.

Επιπλέον, γονιδιακή σίγαση έχει επιτευχθεί σε πολλούς ενδογενείς στόχους σε μοντέλα ασθενειών με το πρότυπο της οξείας πνευμονικής βλάβης (Acute Lung Injury model-ALI)14,15. Συμπερασματικά, οι παραπάνω μελέτες προτείνουν ότι, σε αντίθεση με την συστηματική χορήγηση, κάτω από καθορισμένες συνθήκες η τοπική χορήγηση saline-formulated-siRNΑ δύναται να επάγει σίγαση τόσο σε ιϊκά, όσο και ενδογενή γονίδια που εκφράζονται στα πνευμονικά επιθηλιακά κύτταρα.

Η στοχευόμενη μεταφορά του siRNΑ στον πνεύμονα έχει το πλεονέκτημα ότι, όπως σε κάθε φάρμακο, η δόση που απαιτείται για τη δραστικότητα του είναι ουσιαστικά μικρότερη όταν χορηγείται κοντά στα κύτταρα που στοχεύει. Επιπλέον, η τοπική χορήγηση μειώνει τον κίνδυνο εμφάνισης ενδεχόμενων συστηματικών παρενεργειών. Τελευταίο και πιο σημαντικό είναι ότι στα πλαίσια της θεραπείας των αναπνευστικών νοσημάτων, η ενστάλαξη siRNΑ (για παράδειγμα ενδορινικά ή ενδοτραχειακά) θα μπορούσε να επιτρέψει την άμεση πρόσβαση στα πνευμονικά επιθηλιακά κύτταρα σε μια ποικιλία πνευμονοπαθειών, εκτός από τις ιϊκές λοιμώξεις, όπως είναι η Κυστική Ίνωση, η Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια, το Άσθμα και η Πνευμονική Ίνωση16.

Εντούτοις, η δόμηση των μέσων χορήγησης του siRNΑ πρέπει να είναι τέτοια ώστε να προσφέρει τη μέγιστη δυνατή κυτταρική πρόσληψη, τον καλύτερο δυνατό κυτταροπλασματικό εντοπισμό του siRNΑ, να διευρύνει τον αριθμό των πνευμονικών κυτταρικών υποπληθυσμών που θα μπορούσε να μεταφερθεί το siRNΑ, και επιπλέον να βελτιώσει τη φαρμακοκινητική κατανομή και διασπορά των siRNΑs16. Η ταχεία πρόοδος σε προκλινικό επίπεδο και τα ενθαρρυντικά αρχικά κλινικά αποτελέσματα προτείνουν ότι η "siRNΑ θεραπευτική" έχει τη δυνατότητα να καταλάβει σημαντικό ρόλο στη θεραπεία των νοσημάτων του αναπνευστικού.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

    1. Meister G, Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature 2004;431:343-9.

    2. Mourelatos Z. Small RNAs: The seeds of silence. Nature 2008;455:44-5.

    3. Carmell M, Xuan Z, Zhang MQ, Hannon GJ. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev 2002;16:2733-42.

    4. McManus MT, Sharp PA. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs, Nat Rev Genet 2002;3:737-47.

    5. Wu MT, Wu RH, Hung CF, Cheng TL, Tsai WH, Chang WT. Simple and efficient DNAvector based RNAi systems in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 2005;330:53-9.

    6. Novina CD, Sharp PA. The RNAi revolution. Nature 2004;430:161-4.

    7. Bumcrot D, Manoharan M, Koteliansky V, Sah DW. RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nat Chem Biol 2006;2:711-9.

    8. Reidhaar-Olson JF. Delivering RNAi Therapeutics. Drug Discov Dev 2008;11:22-5.

    9. Thomas M, Lu JJ, Chen J, Klibanov AM. Non-viral siRNA delivery to the lung. Adv Drug Deliver Rev 2007;59:124-33.

  10. Bitko V, Musiyenko A, Shulyayeva O, Barik S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA. Nat Med 2005;11:50-5.

  11. Li BJ, Tang Q, Cheng D, et al. Using siRNA in prophylactic and therapeutic regimens against SARS coronavirus in Rhesus macaque. Nat Med 2005;11:944-51.

  12. Ge Q, Filip L, Bai A, Nguyen T, Eisen HN, Chen J. Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:8676-81.

  13. Tompkins SM, Lo CY, Tumpey TM, Epstein SL. Protection against lethal influenza virus challenge by RNA interference in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:8682-6.

  14. Zhang X, Shan P, Jiang D, et al. Small interfering RNA targeting heme oxygenase-1 enhances ischemia-reperfusion-induced lung apoptosis. J Biol Chem 2004;279:10677-84.

  15. Lomas-Neira JL, Chung CS, Wesche DE, Perl M, Ayala A. In vivo gene silencing (with siRNA) of pulmonary expression of MIP-2 versus KC results in divergent effects on hemorrhage-induced, neutrophil-mediated septic acute lung injury. J Leukoc Biol 2005;77:846-53.

  16. de Fougerolles A, Novobrantseva T. siRNA and the lung: research tool or therapeutic drug? Curr Opin Pharm 2008;8:280-285.

© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE