Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Η εργαστηριακή διάγνωση της νόσου των λεγεωναρίων σε ασθενείς με εξωνοσοκομειακή πνευμονία
ΠΕΡΙΛΗΨΗ. Η επιτυχής αντιμετώπιση της νόσου των λεγεωναρίων εξαρτάται σημαντικά από την ταχύτητα των εργαστηριακών αποτελεσμάτων, ώστε να καταστεί δυνατή η άμεση έναρξη κατάλληλης αντιβιοτικής αγωγής. Μεταξύ των διαφόρων μικροβιολογικών διαγνωστικών μεθόδων, η καλλιέργεια αποτελεί θεωρητικά τη μέθοδο αναφοράς, όμως στην πράξη παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα, σημαντικότερο των οποίων είναι ο παράγοντας “χρόνος”. Πράγματι, το μεγάλο χρονικό διάστημα το οποίο απαιτείται για την απομόνωση του μικροβίου συντελεί ουσιαστικά στην καθυστέρηση εφαρμογής σωστής θεραπευτικής αγωγής, με δυσμενείς συνέπειες ακόμα και για τη ζωή του ασθενούς. Για τους λόγους αυτούς, στη μελέτη μας, η οποία αφορά στη διερεύνηση 88 περιπτώσεων βαρειάς εξωνοσοκομειακής πνευμονίας για πιθανή συμμετοχή της Legionella, δεν εφαρμόστηκε καλλιεργητική μέθοδος, αλλά επιλέχτηκαν οι σύγχρονες μικροβιολογικές διαγνωστικές μέθοδοι. Οι μέθοδοι αυτές πλεονεκτούν διότι παρέχουν τη δυνατότητα άνετης εφαρμογής σε κλινικά εργαστήρια ρουτίνας, εξασφαλίζοντας συγχρόνως γρήγορα και αξιόπιστα εργαστηριακά αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, εφαρμόστηκαν ο άμεσος ανοσοφθορισμός (Direct Fluorescent Antigen-DFA) για την ανίχνευση της Legionella σε πτύελα, ο ορολογικός έλεγχος, με εφαρμογή της μεθόδου ELISA και του έμμεσου ανοσοφθορισμού (Indirect Fluorescent Antibody-IFA) καθώς και μέθοδοι ανίχνευσης του αντιγόνου της Legionella στα ούρα, με την ανοσοενζυμική μέθοδο (Biotest-EIA) και με τη νέα ταχεία μέθοδο της ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης (Binax-NOW). Ο ορολογικός έλεγχος και ο έλεγχος για την ανίχνευση του αντιγόνου της Legionella στα ούρα εφαρμόστηκαν στο σύνολο των 88 ασθενών της μελέτης μας. Παρότι και οι δύο αυτές μέθοδοι έδωσαν θετικά αποτελέσματα στους ίδιους 6 ασθενείς (6,8%), επισημαίνεται σε σύγκριση μεταξύ των δύο, ο έλεγχος για την ανίχνευση του αντιγόνου στα ούρα έδωσε ταχύτατα αποτελέσματα, παρέχοντας τη δυνατότητα άμεσης διάγνωσης στην οξεία φάση της νόσου. Αντίθετα, για τον ορολογικό έλεγχο απαιτήθηκε χρόνος 15, τουλάχιστον, ημερών. Η μέθοδος DFA έδωσε θετικά αποτελέσματα σε 2 μόνο ασθενείς με θετικό ορολογικό έλεγχο (ευαισθησία 33%). Αναφορικά με τις δύο μεθόδους για την ανίχνευση του αντιγόνου της Legionella στα ούρα, αν και οι δύο έδωσαν αντίστοιχα αποτελέσματα, η ταχεία μέθοδος της ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης υπερέχει στο ότι είναι απλούστερη, ταχύτερη, και δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό και εμπειρία προσωπικού. Για τους λόγους αυτούς δύναται να αποτελέσει πολύ καλή εναλλακτική λύση για εργαστήρια μικρών νοσοκομείων τα οποία στερούνται σύγχρονης και επαρκούς τεχνολογικής υποστήριξης. Πνεύμων 2003, 16(2):173-180.

Εισαγωγή

Η νόσος των Λεγεωναρίων αποτελεί βαρειά άτυπη πνευμονία για την οποία ευθύνονται τα βακτήρια του γένους Legionella. Ειδικότερα η Legionella pneumophila οροτύπου Ι είναι υπεύθυνη για το 70-90% των περιπτώσεων. Από την περιγραφή της νόσου, το 1976, καταγράφεται μια προϊούσα αύξηση στη συχνότητα απομόνωσης του βακτηριδίου, σε περιπτώσεις εξωνοσοκομειακής, αλλά και νοσοκομειακής πνευμονίας. Η συχνότητα της νόσου ποικίλλει στις διάφορες χώρες από 1,5-4,5%, ενώ η συμμετοχή της Legionella pneumophila ως αιτίου πνευμονίας της κοινότητας κυμαίνεται από 2-15%. Στις ΗΠΑ, η Legionella αναφέρεται ως υπεύθυνη για 8000-17000 περιπτώσεις εξωνοσοκομειακής πνευμονίας ετησίως, από τις οποίες ένας σημαντικός αριθμός απαιτεί νοσοκομειακή περίθαλψη. Στην Ελλάδα, από δεδομένα του Εθνικού Κέντρου Αναφοράς για τη νόσο των λεγεωναρίων, φαίνεται ότι η γεωγραφική κατανομή της νόσου είναι ευρεία, αφορά δε κυρίως ξενοδοχοϋπαλλήλους και πελάτες ξενοδοχείων. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε υψηλός τίτλος αντισωμάτων για τη νόσο, σε ποσοστό περίπου 10%, μεταξύ υπαλλήλων ξενοδοχείων, σε αντίθεση με κατοίκους περιοχών κοντά σε ξενοδοχεία, οι οποίοι παρουσίασαν θετικό τίτλο σε ποσοστό 2,7%. Στοιχεία, επίσης, του ίδιου κέντρου αναφέρουν ότι η συμμετοχή της Legionella σε λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος είναι <1%1-4.

Η νόσος των Λεγεωναρίων περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα συμπτωμάτων πνευμονικών και εξωπνευμονικών, τα οποία στερούνται ειδικού χαρακτήρα, ώστε η διάγνωση με βάση την κλινική εικόνα είναι αδύνατη, όπως αδύνατη είναι και η διαφοροδιάγνωση από πνευμονίες που οφείλονται σε άλλα κοινά παθογόνα αίτια. Γι' αυτό απαιτείται εγρήγορση, ώστε η Legionella να μην παραλείπεται από το φάσμα των μικροβιακών παραγόντων που ευθύνονται για τη βαρεία εξωνοσοκομειακή, αλλά και νοσοκομειακή πνευμονία5.

Η νόσος δεν απαντά σε συνήθη εμπειρικά σχήματα, αλλά απαιτεί άμεση και ειδική φαρμακευτική αγωγή, από την οποία εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό η τελική έκβαση. Η θνητότητα είναι αρκετά υψηλή, κυμαινόμενη στο 10%, αλλά υπερβαίνει το 25% σε περιπτώσεις ανοσοκαταστολής. Για τους λόγους αυτούς, συνιστάται η προσθήκη μιας μακρολίδης σε συνδυασμό με β-λακτάμες, ή ακόμα και η χρήση νεότερων κινολονών, στις περιπτώσεις εξωνοσοκομειακής πνευμονίας οι οποίες χρήζουν νοσοκομειακής περίθαλψης6.

Ο ρόλος του μικροβιολογικού εργαστηρίου στην αντιμετώπιση της νόσου είναι πρωταγωνιστικός διότι οφείλει να εξασφαλίσει το πλέον αξιόπιστο εργαστηριακό αποτέλεσμα στο μικρότερο χρόνο. Με δεδομένες τις απαιτήσεις αυτές και προκειμένου να διερευνήσουμε τις πιθανότητες συμμετοχής της Legionella σε περιπτώσεις εξωνοσοκομειακής πνευμονίας, εφαρμόσαμε αποκλειστικά σύγχρονες εργαστηριακές μεθόδους διάγνωσης και μελετήσαμε τις δυνατότητες που αυτές προσφέρουν στην πράξη.

Υλικό και Μέθοδος

Το υλικό της μελέτης μας αποτέλεσαν 88 περιπτώσεις βαρειάς εξωνοσοκομειακής πνευμονίας που αντιμετωπίσθηκαν στο νοσοκομείο "Σωτηρία", κατά τη περίοδο μεταξύ Ιουνίου 2001-Ιουνίου 2002, για τις οποίες έγινε προσπάθεια διερεύνησης της συμμετοχής της Legionella ως υπεύθυνου αιτιολογικού παράγοντα. Συγκεκριμένα, εξετάστηκαν:

α) Δείγματα πτυέλων, για ανίχνευση του βακτηριδίου με τη μέθοδο του άμεσου ανοσοφθορισμού (Direct Fluorescent Antigen-DFA), με μονοκλωνικά αντισώματα, χρησιμοποιώντας το ανάλογο αντιδραστήριο της εταιρείας Gull Laboratories. Ο έλεγχος αυτός εφαρμόστηκε σε μέρος του συνολικού αριθμού των ασθενών της μελέτης και συγκεκριμένα σε 46 ασθενείς.

β) Δείγματα ορού αίματος για προσδιορισμό του τίτλου IgG και IgM αντισωμάτων έναντι της Legionella. Ελέγχθηκε το σύνολο των ασθενών (88/88), με ταυτόχρονη εφαρμογή της ανοσοενζυμικής μεθόδου ELISA, αλλά και της μεθόδου του έμμεσου ανοσοφθορισμού (Indirect Fluorescent Assay - IFA). Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν, για την μέθοδο ELISA, το αντιδραστήριο "Serion ELISA classic" της εταιρείας Virion-Serion, το οποίο ελέγχει τους οροτύπους της Legionella pneumophila 1-7, ενώ για τον έμμεσο ανοσοφθορισμό το αντιδραστήριο "L. pneumophila IFT" της εταιρείας Gull Laboratories, το οποίο ελέγχει τους οροτύπους 1-8. Ειδικότερα, για τη μέθοδο ELISA, τίτλοι αντισωμάτων IgG > 70 U/ml θεωρήθηκαν θετικοί, ενώ < 50 U/ml αρνητικοί. Προκειμένου για τα IgM αντισώματα, τίτλοι > 140 U/ml θεωρήθηκαν θετικοί, ενώ < 120 U/ml αρνητικοί. Για τη μέθοδο IFA, εξ άλλου, τίτλοι > 1:128 θεωρήθηκαν θετικοί, τόσο για τα IgG, όσο και για τα IgM αντισώματα. Ο ορολογικός έλεγχος εφαρμόστηκε σε δύο δείγματα με διαφορά χρόνου 15 περίπου ημερών, για να διαπιστωθεί η ορομεταστροφή.

γ) Δείγματα ούρων, για ανίχνευση του αντιγόνου της Legionella. Εξετάστηκε το σύνολο των ασθενών της μελέτης (88/88), με παράλληλη εφαρμογή δύο μεθόδων, αφενός της ELISA, με το αντιδραστήριο "Biotest EIA" της εταιρείας Biotest και αφετέρου, της νέας ταχείας μεθόδου ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης (Immunochromatographic Αssay-ICT) με το αντιδραστήριο "Binax NOW", της εταιρείας Binax. Η εφαρμογή δύο μεθόδων κρίθηκε απαραίτητη, εξ αιτίας του γεγονότος ότι, η μέθοδος ICT-Binax NOW παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία για την ανίχνευση της Legionella pneumophila οροτύπου 1, ενώ η μέθοδος Biotest EIA ανιχνεύει μεγαλύτερο φάσμα οροτύπων, αλλά και άλλων ειδών Legionella.

Η μέθοδος της ταχείας ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης, Binax NOW, έχει πρόσφατη εφαρμογή στη διαγνωστική των λεγιωνελλώσεων, ειδικότερα δε στην Ελλάδα, εφαρμόζεται το τελευταίο έτος. Πρόκειται για μία διάταξη, στην οποία anti-L. pneumopila οροτύπου 1 αντισώματα κονίκλου (rabbit anti-L.pneumophila οροτύπου 1) απορροφώνται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (γραμμή εξεταστέου - θέση Γ), ενώ αντισώματα κατσίκας (goat anti-rabbit IgG) απορροφώνται πάνω στην ίδια μεμβράνη, σε δεύτερο σημείο (γραμμή μάρτυρος - θέση Δ). Ένα δεύτερο σύστημα αντισωμάτων rabbit anti-L. pneumophila οροτύπου 1, συνδεδεμένων με σωματίδια κολλοειδούς χρυσού είναι απορροφημένα σε ένα ινώδες υπόστρωμα, το οποίο είναι προσαρμοσμένο στη μεμβράνη (θέση Β) και σε συνδυασμό με αυτή, συνθέτει την όλη διάταξη. Σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρείας, ένας στυλεός, ο οποίος έχει προηγουμένως εμβαπτιστεί στο δείγμα των ούρων, τοποθετείται σε ειδική υποδοχή (θέση Α) και στη συνέχεια προστίθενται λίγες σταγόνες ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικών αλάτων για να βοηθηθεί η μετακίνηση του αντιγόνου πάνω στη μεμβράνη (Σχήμα 1, Εικόνα 1). Τα αντισώματα rab bit anti-L. pneumophila οροτύπου 1, που είναι συνδεδεμένα με σωματίδια κολλοειδούς χρυσού στη θέση Β, συνδέονται με τα αντιγόνα της L. pneumophila οροτύπου 1, εφ'όσον αυτά υπάρχουν στο δείγμα των ούρων και το σύμπλεγμα αντιγόνου-συνδεδεμένου αντισώματος δεσμεύεται από τα ακινητοποιημένα αντισώματα κονίκλου anti-L. pneumophila οροτύπου 1, στη θέση Γ, σχηματίζοντας τη γραμμή του εξεταστέου. Επί πλέον, τα ακινητοποιημένα αντισώματα κατσίκας anti-rabbit IgG, δεσμεύουν την περίσσεια του συνδεδεμένου αντισώματος, σχηματίζοντας τη γραμμή του μάρτυρα, στη θέση Δ. Το αποτέλεσμα είναι ορατό σε 15 λεπτά. Εάν είναι θετικό σχηματίζονται δύο ροζ γραμμές, μία στη θέση του εξεταστέου και μία στη θέση του μάρτυρα, ενώ εάν είναι αρνητικό, σχηματίζεται μία γραμμή, στη θέση του μάρτυρα.

Image 1
Εικόνα 1. Φωτογραφική απεικόνιση θετικού δείγματος με τη μέθοδο ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης Binax NOW Legionella urinary antigen.
 
Figure 1
Α: Θέση Δείγματος, Β: Θέση αντισώματος anti-legionella οροτύπου Ι, συνδεδεμένου με σωτίδια κολλοειδούς χρυσού, Γ: Γραμμή εξεταστέου, Δ: Γραμμή μάρτυρα, Ε: Μεμβράνη νιτροκυτταρίνης
Σχήμα 1. Σχηματική απεικόνιση της τραχείας ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης (ICT) για την ανίχνευση του αντιγόνου της Legionella οροτύπου Ι στα ούρα. (α) Επισκόπηση εκ των άνω, (β) Σε κάθετη τομή.

Αποτελέσματα

Τα συνολικά αποτελέσματα της μελέτης μας περιλαμβάνονται στον πίνακα 1, αναλυτικά δε, έχουν ως ακολούθως:

α) Η ανίχνευση της Legionella στα πτύελα, με μέθοδο DFA, ήταν θετική σε 2 από τους 46 (4,3%) ασθενείς, δεδομένου ότι, όπως αναφέρθηκε, η μέθοδος δεν εφαρμόσθηκε στο σύνολο των ασθενών.

β) Ο ορολογικός έλεγχος απεδείχθει θετικός για λεγεωνέλλωση σε 6/88 ασθενείς (6,8%) τόσο με μέθοδο ELISA όσο και με IFA. Οι τίτλοι αντισωμάτων IgG και IgM, έδειξαν σημαντική άνοδο, μεταξύ δύο διαδοχικών μετρήσεων σε χρονικό διάστημα δύο εβδομάδων και με τις δύο μεθόδους που εφαρμόστηκαν. Το μέγεθος του αποτελέσματος ήταν, επίσης, ανάλογο μεταξύ των δύο μεθόδων.

γ) Η ανίχνευση του αντιγόνου της Legionella στα ούρα ήταν θετική σε 6/88 (6,8%) ασθενείς, σ' αυτούς τους οποίους και ο ορολογικός έλεγχος ήταν θετικός. Σημειώθηκε απόλυτη αντιστοιχία στα θετικά και αρνητικά αποτελέσματα των δύο μεθόδων που εφαρμόστηκαν, δηλαδή της Biotest EIA και της ICT-Binax NOW, ενώ και οι δύο μέθοδοι θετικοποιήθηκαν σχεδόν ταυτόχρονα, δηλαδή την 2η - 3η ημέρα από την έναρξη των συμπτωμάτων. Το μέγεθος του αποτελέσματος επίσης, ήταν ανάλογο και στις δύο μεθόδους. Συγκεκριμένα, σε 3 περιπτώσεις ήταν εντόνως θετικό, ενώ στις άλλες 3, ασθενώς θετικό.

Σε σύγκριση με την ανίχνευση του αντιγόνου στα ούρα, αλλά και τις ορολογικές μεθόδους, η μέθοδος DFA είχε ευαισθησία 33% (ανιχνεύθηκε μόνο σε 2 από τις 6 περιπτώσεις λεγιωνέλλωσης).

Table 1

Συζήτηση

Είναι γεγονός ότι η πρόοδος που σημειώνεται σήμερα στον τομέα της εργαστηριακής διαγνωστικής, έχει συμβάλλει ουσιαστικά στην διαρκώς αυξανόμενη αναγνώριση της Legionella ως συχνού, αλλά και ταυτόχρονα πολύ σοβαρού λοιμογόνου παράγοντα. Πράγματι, διάφορες δυσκολίες στην εφαρμογή καταλλήλων μεθόδων ευθύνονται ουσιαστικά, για το ότι, η νόσος μέχρι σήμερα συχνά υποδιαγνώσθηκε, αλλά και υπερθεραπεύθηκε.

Η καλλιέργεια των πτυέλων, η κλασσική και παλαιότερη μέθοδος για τη διάγνωση της νόσου, παραμένει θεωρητικά η μέθοδος αναφοράς. Όμως, ποικίλλοι παράγοντες μειώνουν την ευαισθησία της στην πράξη και συνεπώς την αξία της. Σημαντικότερα μειονεκτήματά της θεωρούνται η ανάγκη μακρού χρόνου επώασης, ειδικών καλλιεργητικών υλικών και εμπειρίας, καθώς επίσης, η αδυναμία παραγωγής πτυέλων από το ήμισυ και πλέον των ασθενών (20-70%), η δυσκολία του μικροβίου να επιβιώνει στις εκκρίσεις του αναπνευστικού συστήματος αλλά και να αναπτύσσεται, όταν έχει προηγηθεί θεραπεία με αντιβιοτικά. Η ευαισθησία της μεθόδου κυμαίνεται μεταξύ <10 έως 80% ανάλογα με τη μέθοδο σύγκρισης. Παρότι η υψηλότερη ευαισθησία καταγράφεται σε εργαστήρια αναφοράς, ακόμα και στις περιπτώσεις αυτές, αποδεικνύεται<50% συγκρινόμενη με τον ορολογικό έλεγχο. Όσον αφορά την ευαισθησία της καλλιέργειας της Legionella από δείγματα αίματος, αυτή είναι <10% διότι αν και το μικρόβιο πολλαπλασιάζεται στις καλλιεργητικές φιάλες, η ανάπτυξη δεν είναι ικανή να ενεργοποιήσει το συναγερμό των σύγχρονων αυτοματοποιημένων συστημάτων1,5-7.

Η ανίχνευση του βακτηριδίου σε πτύελα ή βρογχικές εκκρίσεις με τη μέθοδο του άμεσου ανοσοφθορισμού (Direct Fluorescent Antigen-DFA) είναι μεν ταχεία, δεδομένου ότι εξασφαλίζει αποτέλεσμα σε 2-4 ώρες, αλλά απαιτεί ιδιαίτερη εμπειρία. Η ευαισθησία της μεθόδου σε σχέση με τον ορολογικό έλεγχο είναι <50%, η δε ειδικότητα ~94%. Η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων στην εφαρμογή της μεθόδου, μείωσε σημαντικά τις διασταυρούμενες αντιδράσεις. Ο άμεσος ανοσοφθορισμός δεν είναι ευρέως αποδεκτός, το δε αποτέλεσμα πρέπει να εκτιμάται σε συνδυασμό με την κλινική εικόνα. Στη μελέτη μας, ο άμεσος ανοσοφθορισμός στα πτύελα είχε ευαισθησία 33% σε σχέση με τον ορολογικό έλεγχο, ποσοστό που συμφωνεί με τα αναφερόμενα στη βιβλιογραφία6,7.

Οι δυσκολίες που αναφέρθηκαν σχετικά με την καλλιέργεια και τον άμεσο ανοσοφθορισμό, οδήγησαν στην ευρεία εφαρμογή του ορολογικού ελέγχου. Αυτός γίνεται με προσδιορισμό των IgM και IgG ειδικών αντισωμάτων με τη μέθοδο ELISA καθώς και με έμμεσο ανοσοφθορισμό (Indirect Fluorescent Antibody-IFA).Ο ορολογικός έλεγχος αποτελεί, πράγματι, αξιόλογο διαγνωστικό μέσο, αλλά μειονεκτεί σημαντικά στο ότι δεν παρέχει δυνατότητα διάγνωσης στην οξεία φάση της λοίμωξης. Ειδικότερα, ο προσδιορισμός, όμως, των IgM αντισωμάτων δεν θεωρείται αξιόπιστος για τη διάγνωση της οξείας φάσης, δεδομένου ότι τα IgM αντισώματα είναι δυνατόν να παραμείνουν θετικά για μεγάλο χρονικό διάστημα, ενώ διαγνωστικό τίτλο στο τέλος της πρώτης εβδομάδας εμφανίζουν λιγότεροι από τους μισούς ασθενείς. Η ορομεταστροφή, εξάλλου, δηλαδή ο τετραπλασιασμός του τίτλου, καθυστερεί 4-6 εβδομάδες, προσδίδοντας στον ορολογικό έλεγχο μόνο αναδρομική αξία. Επιπλέον, αρκετοί ασθενείς (20-30%), δεν αναπτύσσουν σημαντικό τίτλο αντισωμάτων, ούτε και ορομεταστροφή, η οποία άλλωστε επέρχεται σε ποσοστό <50%, ενώ σε 20% των ασθενών δεν επέρχεται ποτέ, ανεξαρτήτως του είδους και του οροτύπου της Legionella που ευθύνεται για τη νόσο. Η ορομεταστροφή ελέγχεται με την εξέταση δεύτερου δείγματος ορού σε χρόνο 2-3 εβδομάδων από το πρώτο. Η πλέον αξιόπιστη μέθοδος ορολογικού ελέγχου θεωρείται ο έμμεσος ανοσοφθορισμός. Τίτλος >1:256 αποτελούσε στο παρελθόν, όχι όμως σήμερα, επαρκές διαγνωστικό κριτήριο, σε συνδυασμό πάντα με την κλινική εικόνα. Η ευαισθησία του ορολογικού ελέγχου ανέρχεται στο 75%, συγκρινόμενη με περιπτώσεις που η καλλιέργεια είναι θετική1,2,7,8.

Στη μελέτη μας, από την εφαρμογή του ορολογικού ελέγχου, θετικές για τη νόσο των λεγεωναρίων απεδείχθησαν οι 6/88 (6,8%) περιπτώσεις εξωνοσοκομειακής πνευμονίας, σε αντίθεση με ποσοστά<1%που καταγράφονται σε μελέτη του Εθνικού Κέντρου Αναφοράς για τη Legionella το 1984 στην Ελλάδα, η οποία έγινε με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού. Σημειώνεται, η σχετικά μεγάλη χρονική απόσταση μεταξύ των δύο μελετών, η έλλειψη στοιχείων ως προς τη γεωγραφική προέλευση των ασθενών καθώς και η έλλειψη επιδημιολογικών δεδομένων, σχετικά με την ηλικία ,το επάγγελμα, την υποκείμενη νόσο κ.λπ. των ασθενών. Στη μελέτη μας, τόσον ο έμμεσος ανοσοφθορισμός όσον και η μέθοδος ELISA έδειξαν απολύτως αντίστοιχα αποτελέσματα και ίσες δυνατότητες.

Με δεδομένη τη βαρύτητα της νόσου, την υψηλή θνητότητα, τις θεραπευτικές απαιτήσεις, τις εργαστηριακές δυσκολίες και τη σημασία της έγκαιρης διάγνωσης , ήταν αναμενόμενη η ανάπτυξη μεθόδων υψηλής ευαισθησίας και ειδικότητας, με ταυτόχρονη ελαχιστοποίηση του χρόνου εξαγωγής του αποτελέσματος.

Για το σκοπό αυτό, εδώ και αρκετά χρόνια, σημειώνεται ένα ιδιαίτερο ενδιαφέρον σχετικά με την ανίχνευση του ειδικού διαλυτού λιποπολυσακχαριδικού αντιγόνου (LPS) της Legionella στα ούρα, δεδομένης της ευκολίας διάθεσης του συγκεκριμένου δείγματος, αλλά και της φυσικής συμπυκνωτικής ικανότητας των νεφρών, με την οποία επιτυγχάνεται ικανοποιητική συγκέντρωση του αντιγόνου του μικροβίου. Πράγματι, 80% των ασθενών με τη νόσο των λεγεωναρίων εκκρίνουν το διαλυτό αντιγόνο στα ούρα, από την 1η-3η ημέρα της λοίμωξης και για χρονικό διάστημα τουλάχιστον 42-50 ημερών1,2,5-7. Όλες σχεδόν οι μέθοδοι, οι οποίες έχουν αναπτυχθεί στην κατεύθυνση αυτή, στοχεύουν κυρίως στην ανίχνευση του αντιγόνου της Legionella οροτύπου 1, εξ αιτίας της μεγαλύτερης συχνότητας της. Η ευαισθησία όλων των μεθόδων, συγκριτικά με περιπτώσεις με θετική καλλιέργεια, κυμαίνεται στο 86-93%, η δε αξιοπιστία τους είναι τόσο μεγάλη, ώστε σήμερα η διάγνωση της νόσου να θεωρείται βέβαιη, εφ'όσον έχει καταγραφεί θετικό αποτέλεσμα σε μία απ'αυτές6,9. Τα μεγαλύτερα πλεονεκτήματα, όμως, είναι η ταχύτητα στην εξαγωγή αποτελέσματος και η δυνατότητα προσδιορισμού του αντιγόνου ακόμη και μετά από την έναρξη της θεραπείας. Οι μέθοδοι διατίθενται στο εμπόριο, σε έτοιμη συσκευασία, συνδυάζοντας ένα ακόμη πλεονέκτημα, και συγκεκριμένα την εύκολη εφαρμογή1,2,5-7.

Η ραδιομετρική μέθοδος (RIA) κατέχει ιστορικά την πρώτη θέση ανάμεσα στις συγκεκριμένες μεθόδους και για πολλά χρόνια αποτελούσε τη μέθοδο επιλογής. Η χρήση ραδιενεργών και η ως τούτου, αδυναμία εφαρμογής της σε κοινά εργαστήρια, συνέβαλε στην προώθηση της ανοσοενζυμικής μεθόδου (ΕΙΑ), η οποία την αντικατέστησε. Δύο είναι οι βασικοί εκπρόσωποι της ΕΙΑ, η Binax EIA, της εταιρείας Binax, και η Biotest EIA της εταιρείας Biotest, με ευαισθησία 79,1% και 83,4% αντίστοιχα και ειδικότητα 100% και για τις δύο. (1) Σύμφωνα με περισσότερο αισιόδοξες απόψεις, η ευαισθησία της Binax EIA ανέρχεται στο 91% και της Biotest στο 97%, (2) Η πρώτη ανιχνεύει καλύτερα την Legionella pneumophila οροτύπου 1, ενώ η δεύτερη ανιχνεύει και άλλα επιπλέον είδη, όπως την Legionella macdadei, η οποία είναι το δεύτερο είδος σε συχνότητα, αλλά και άλλους οροτύπους Legionella pneumophila, επιπλέον του οροτύπου 1, όπως τους 3, 4, 6, 8. Αδυνατεί όμως να προσδιορίσει συγκεκριμένο ορότυπο ή είδος του βακτηρίου5,10.

Η πλέον σύγχρονη από τις μεθόδους ανίχνευσης του αντιγόνου της Legionella στα ούρα, είναι η μέθοδος της ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης, η οποία εφαρμόζεται με το αντιδραστήριο Binax Now, της εταιρείας Binax, με ευαισθησία 79,7% και ειδικότητα 100%. Η μέθοδος θετικοποιείται από τη 1η με 3η ημέρα της νόσου, είναι απλή, ταχύτατη, απαιτώντας χρόνο μόλις 15 λεπτών, έναντι 2 ωρών της ΕΙΑ, ενώ δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό, ούτε ειδική εμπειρία. Η σχετικά μικρότερη ευαισθησία της, συγκριτικά με τη μέθοδο Biotest EIA, αποδίδεται στο ότι ανιχνεύει μόνο τη Legionella pneumophila οροτύπου 1, σε αντίθεση με τη Biotest EIA, η οποία ανιχνεύει ευρύτερο φάσμα ειδών Legionella, όπως ήδη αναφέρθηκε. Η συμπύκνωση των ούρων φαίνεται ότι αυξάνει σημαντικά την ευαισθησία της μεθόδου, τουλάχιστον κατά 20-25%1,8,11.

Αναφορικά με τα αποτελέσματα της μελέτης μας από την εφαρμογή του ελέγχου ανίχνευσης του αντιγόνου της Legionella στα ούρα, αυτός δε φαίνεται να υπερτερεί σε ποσοστά έναντι του ορολογικού ελέγχου, (6,8% και 6,8% αντίστοιχα) με μόνη διαφορά την ταχεία έκδοση αποτελεσμάτων, γεγονός με αποφασιστική σημασία για την πορεία της νόσου. Μεταξύ των δύο μεθόδων που εφαρμόστηκαν στη μελέτη μας για την ανίχνευση του αντιγόνου στα ούρα, δηλαδή της ανοσοενζυμικής και της ταχείας ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης, δεν σημειώθηκαν διαφορές ως προς τον αριθμό των θετικών περιπτώσεων που διαγνώστηκαν, με μόνη παρατήρηση την ευκολότερη εφαρμογή της δεύτερης σε σχέση με την πρώτη. Το γεγονός ότι η παρουσία του αντιγόνου στα ούρα είναι δυνατόν να παραμείνει επί μακρόν, συνήθως 45-50 μέρες, μπορεί να προκαλέσει δυσκολίες στην εκτίμηση δεδομένων σε ορισμένες περιπτώσεις.

Θα ήταν παράληψη, η μη αναφορά στις μοριακές μεθόδους ανίχνευσης της Legionella και ειδικότερα στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR). Η μέθοδος ανιχνεύει επιτυχώς το βακτήριο σε κλινικά δείγματα και δείγματα από το περιβάλλον, επιδεικνύοντας ευαισθησία ίση ή μεγαλύτερη από αυτή της καλλιέργειας. Η ευαισθησία της PCR είναι μεγαλύτερη στις πρώτες ημέρες της νόσου. Δείγμα επιλογής θεωρούνται τα πτύελα, ενώ ο ορός και τα ούρα δεν εξασφαλίζουν υψηλή ευαισθησία στη μέθοδο. Παρ'όλα τα πλεονεκτήματα της PCR, η εμπειρία, ο ειδικός εξοπλισμός και το υψηλό κόστος περιορίζουν την εφαρμογή της σε ερευνητικά εργαστήρια7.

Συμπερασματικά, μέσα στο όλο φάσμα των εργαστηριακών μεθόδων ρουτίνας για τη διάγνωση της νόσου των λεγεωναρίων, η καλλιέργεια παραμένει, θεωρητικά, η μέθοδος αναφοράς, λόγοι όμως πρακτικοί επιβάλλουν σήμερα διέξοδο σε άλλες πλέον σύγχρονες μεθόδους. Από αυτές, η ανίχνευση του αντιγόνου της Legionella στα ούρα, αποτελεί μία ρεαλιστική λύση διότι, εξασφαλίζει άριστα αποτελέσματα από τις πρώτες ημέρες της νόσου, δεν επηρεάζεται από τη χορήγηση αντιβιοτικών και εφαρμόζεται σε δείγμα εύκολα διαθέσιμο. Γι' αυτό πρέπει να εφαρμόζεται πάντα, ανεξαρτήτως της μεθόδου που επιλέγεται, δηλαδή της ανοσοενζυμικής ή της ταχείας ανοσοχρωματογραφίας μεμβράνης. Επισημαίνεται, όμως, ότι από αυτές η δεύτερη παρέχει επιπλέον δυνατότητα εύκολης εφαρμογής ακόμη και σε εργαστήρια μικρών νοσοκομείων με περιορισμένο εξοπλισμό, σε αντίθεση με τη μέθοδο ELISA η οποία απαιτεί σύγχρονη και αρτιότερη τεχνολογική υποστήριξη.

 

Βιβλιογραφία

1. Helbig JH, Uldum SA, Luck PC, Harrison TG. Detection of Legionella pneumophila antigen in urine samples by the Binax NOW immunochromatographic assay and comparison with both Binax Legionella Urinary Enzyme Immunoassay (EIA) and Biotest Legionella Urin Antigen EIA. J Med Microbiol 2001; 50: 509-516.

2. Αλεξίου-Δανιήλ Σ, Τέα Α, Μανίκα Α, Αντωνιάδης Α. Ανίχνευση του ελεύθερου αντιγόνου της Legionella στα ούρα με ανοσοενζυμική τεχνική (ELISA). Σύγκριση δύο εμπορικών αντιδραστηρίων. Δελτίο Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας 2002; 47: 41-46.

3. Παπαπαναγιώτου Ι, Αλεξίου-Δανιήλ Σ, Ντελόπουλος Μ, ΣτεφάνουΘ, Αντωνιάδης Α. Έρευνα επί της νόσου των λεγεωναρίων στην Ελλάδα. Ιατρική 1984; 45: 217-220.

4. Αλεξίου-Δανιήλ Σ, Παπαπαναγιώτου Ι, Στεφάνου Θ. Λεγιονέλλωση στην Ελλάδα. Ελληνική Ιατρική 1988; 54, 3: 206-212.

5. Dominguez JA, Gali N, Pedroso P, Fargas A, Padilla E, Manterola JM, Matas L. Comparison of the Binax Legionella Urinary Antigen Enzyme Immunoassay (EIA) with the Biotest Legionella Urin Antigen EIA for detection of Legionella antigen in the concentrated and nonconcentrated urine samples. J Clin Microbiol 1998; 36(9): 2718-2722.

6. Waterer GW, Baselski VS, Wunderink RG. Legionella and community-acquired pneumonia: A review of current diagnostic tests from a clinician's viewpoint. Am J Med 2001; 110: 41-48.

7. Murdoch DR. Diagnosis of Legionella infection. Clin Infect Dis 2003; 36: 64-69.

8. Dominguez J, Galf N, Matas L, Pedreso P, Hernandez A, Padilla E, Ausina V. Evaluation of a Rapid Immunochromatographic Assay for the detection of Legionella antigen in urine samples. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999; 18: 896-898.

9. Plouffe JF, File TM, Breiman RF. Reevaluation of the definition of Leginnaires'disease: use of the urinary antigen assay. Clin Infect Dis 1995; 20:1286-1291.

10. Knirsch CA, Jakob K, Schoonmaker D, Kieehlbauch J, Wong SJ, Della-Latta P, Whittier S, Layton M, Scully B. An outbreak of Legionella micdadei pneumonia in transplant patients: evaluation, molecular epidemiology and control. Am J Med 2000; 108: 290-295.

11. Okada C, Kura F, Wada A, Inagawa H, Lee GH, Matsushita H. Cross reactivity and sensitivity of two Legionella Urinary Antigen Kits, Biotest EIA and Binax NOW, to extracted antigens form various serogroups of L. pneumophila and other Legionella species. Microbiol Immunol 2002; 46(1): 51-54.

© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE