Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Έκφραση περφορίνης και κυτταροτοξική δραστηριότητα των CD8+ λεμφοκυττάρων στα πτύελα καπνιστών με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (X.A.Π.)
Είναι γνωστό ότι το κάπνισμα αποτελεί τον κύριο αιτιολογικό παράγοντα που σχετίζεται με την ανάπτυξη Χρόνιας Aποφρακτικής Πνευμονοπάθειας (Χ.Α.Π.). Η Χ.Α.Π. χαρακτηρίζεται από παθολογική φλεγμονώδη απάντηση των αεραγωγών σε διάφορα ερεθίσματα, στην οποία συμμετέχουν ουδετερόφιλα, Τ-λεμφοκύτταρα, μακροφάγα και ηωσινόφιλα. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να ερευνήσει τη συμμετοχή των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων στη φλεγμονώδη διαδικασία που χαρακτηρίζει τη νόσο. Ιδιαίτερα μελετήθηκαν η έκφραση της περφορίνης των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων και η κυτταροτοξική τους δραστηριότητα. Στη μελέτη συμμετείχαν 36 άνδρες καπνιστές με Χ.Α.Π., 25 άνδρες καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. και 10 υγιείς μη καπνιστές. O προσδιορισμός των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων στο πτύελο πραγματοποιήθηκε με ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα αντί-CD3-F.I.T.C και αντί-CD8-F.I.T.C. Η έκφραση της περφορίνης αξιολογήθηκε με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι - περφορίνη-F.I.T.C. Η κυτταροτοξική δραστηριότητα των CD8+ λεμφοκυττάρων προσδιορίστηκε επωάζοντας τα CD8+ λεμφοκύτταρα με κύτταρα στόχους (Κ562). Βρέθηκε ότι το ποσοστό και ο απόλυτος αριθμός των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένος στους καπνιστές με Χ.Α.Π. σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. (p = 0,005) και τους υγιείς μη καπνιστές (p = 0,0001). Οι καπνιστές με Χ.Α.Π. παρουσίασαν επίσης στατιστικά σημαντική αύξηση της έκφρασης της περφορίνης και αυξημένη κυτταροτοξική δραστηριότητα των CD8+ λεμφοκυττάρων σε σχέση με τις άλλες δύο ομάδες της μελέτης (p < 0,05). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα CD8+ λεμφοκύτταρα στο πτύελο ασθενών με Χ.Α.Π. εκφράζουν μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. Η κυτταροτοξικότητα πιθανόν ασκείται μέσω της αυξημένης απελευθέρωσης περφορίνης. Πνεύμων 2002, 15(1)93-101.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (Χ.Α.Π.) χαρακτηρίζεται από μη πλήρως αναστρέψιμη απόφραξη των αεραγωγών, η οποία σχετίζεται με μια παθολογική φλεγμονώδη αντίδραση των αεραγωγών σε διάφορα τοξικά σωματίδια ή αέρια1. Αν και το κάπνισμα είναι ο κύριος παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη της Χ.Α.Π., μόνο μια υποομάδα καπνιστών αναπτύσσουν κλινικά σημαντική απόφραξη των αεραγωγών2. Φλεγμονώδη κύτταρα, όπως ουδετερόφιλα, μακροφάγα και Τ-λεμφοκύτταρα (ιδιαίτερα κυτταροτοξικά CD8+), συμμετέχουν στη φλεγμονώδη διαδικασία που χαρακτηρίζει τη νόσο. Τα ενεργοποιημένα φλεγμονώδη κύτταρα με τη σειρά τους απελευθερώνουν μια ποικιλία μεσολαβητών, που περιλαμβάνουν την ιντερλευκίνη-8 (IL-8), τον παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF-α), τα λευκοτριένια B4 (LTB4) καθώς και άλλους παράγοντες οι οποίοι είναι ικανοί να καταστρέψουν το πνευμονικό παρέγχυμα και να συντηρήσουν την ουδετεροφιλική φλεγμονή των αεραγωγών που χαρακτηρίζει τη νόσο3-5.

Τα κυτταροτοξικά CD8+ λεμφοκύτταρα πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της Χ.Α.Π. Πρόσφατα αρκετές μελέτες σε βιοψίες βρόγχου εστιάζονται στο ρόλο των παραπάνω κυττάρων στους κεντρικούς και περιφερικούς αεραγωγούς καπνιστών με Χ.Α.Π.6,7. Σε σύγκριση με καπνιστές, που δεν παρουσιάζουν περιορισμό της ροής του αέρα, οι ασθενείς με Χ.Α.Π. έχουν αυξημένους αριθμούς κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων στους μικρούς και στους μεγάλους αεραγωγούς. Τα παραπάνω κύτταρα έχουν βρεθεί επίσης να διηθούν το πνευμονικό παρέγχυμα και τις πνευμονικές αρτηρίες, αποδεικνύοντας τη συστηματικότητα της φλεγμονώδους αντίδρασης που οδηγεί στην ανάπτυξη της νόσου. Η επικράτηση των CD8+ κυττάρων, τόσο στις βιοψίες βρόγχου, όσο και στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, αποτελεί μια σαφή διαφορά μεταξύ καπνιστών με Χ.Α.Π. και καπνιστών χωρίς περιορισμό της ροής του αέρα. Παρόλα αυτά, ο ακριβής ρόλος και ο μηχανισμός δράσης των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων στη φλεγμονώδη διαδικασία που χαρακτηρίζει τη νόσο παραμένουν αδιευκρίνιστοι. Μελέτες που επικεντρώνονται στην κυτταροτοξική δραστηριότητα των CD8+ λεμφοκυττάρων, αναφέρουν ότι τα συγκεκριμένα κύτταρα μπορούν να προκαλέσουν κυτταρόλυση και απόπτωση των κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων μέσω της απελευθέρωσης περφορίνης και του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF-α)8.

Στην παρούσα μελέτη ερευνήθηκε η συμβολή των κυτταροτοξικών CD8+ κύτταρων στην παθογένεια της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθεια σε δείγματα πτυέλου ασθενών με Χ.Α.Π, που είχαν ληφθεί κατόπιν διαδικασία πρόκλησης, με εισπνοή αερολύματος υπέρτονου διαλύματος χλωριούχου νατρίου. Η κυτταροτοξική δραστηριότητα των CD8+ λεμφοκυττάρων σε καπνιστές με Χ.Α.Π. συγκρίθηκε με αυτή καπνιστών χωρίς Χ.Α.Π. και υγιών μη καπνιστών.

ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ

Mελετήθηκαν συνολικά 71 άτομα. Από αυτά, τα τριάντα έξι (36) ήταν άνδρες καπνιστές με Χ.Α.Π. Η διάγνωση τους βασίστηκε σε δημοσιευμένα κριτήρια ομοφωνίας2. Οι ασθενείς δεν είχαν οξεία παρόξυνση της νόσου τις τελευταίες τέσσερις εβδομάδες πριν τη μελέτη και κανένας δεν είχε λάβει αντιβιοτικά ή κορτικοστεροειδή συστηματικά κατά την αντίστοιχη χρονική περίοδο. Επιπρόσθετα μελετήθηκε μια ομάδα 25 καπνιστών χωρίς Χ.Α.Π. και μία ομάδα 10 υγιών μη καπνιστών. Οι εθελοντές καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. δεν είχαν ιστορικό καρδιακής ή αναπνευστικής νόσου και είχαν φυσιολογική πνευμονική λειτουργία. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου και όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη έδωσαν τη συγκατάθεση τους.

Σπιρομέτρηση

Η σπιρομέτρηση πραγματοποιήθηκε με ένα αυτοματοποιημένο σύστημα (ΜasterLAb, Jaeger 2.12, Germany) σύμφωνα με προτυποποιημένες οδηγίες9. Οι συμμετέχοντες δεν χρησιμοποίησαν βρογχοδιασταλτικά βραχείας δράσεως τις τελευταίες 6 ώρες πριν από τις μετρήσεις και δεν είχαν καπνίσει ή πιει τσάι ή καφέ το πρωί της μέτρησης. Χρησιμοποιήθηκαν οι προβλεπόμενες τιμές που αναφέρονται στα νέα πρότυπα των δοκιμασιών της πνευμονικής λειτουργίας9.

Πρόκληση πτυέλων (Sputum induction)

Η πρόκληση πτυέλων έγινε με εισπνοή υπέρτονου διαλύματος χλωριούχου νατρίου, το οποίο παραγόταν από νεφελοποιητή υπερήχων (Ultra Neb 2000, DeVilbiis, Sormeset, PA, USA), σύμφωνα με προτυποποιημένη μέθοδο10. Ο νεφελοποιητής ρυθμίστηκε σε ροή 1.5ml/min και τα παραγόμενα σωματίδια είχαν διάμετρο 4.5μm. Νεφελοποιήθηκαν διαλύματα χλωριούχου νατρίου 3%, 4% και 5% σε θερμοκρασία δωματίου (20-25° C) και χορηγήθηκαν με σωλήνα μήκους 100 cm και εσωτερικής διαμέτρου 22 mm. Τα δείγματα πτυέλου τοποθετήθηκαν σε αποστειρωμένο πλαστικό τρυβλίο και σε θερμοκρασία 4° βαθμών Κελσίου μέχρι την επεξεργασία τους. Η διαδικασία της πρόκλησης τερματιζόταν μετά από τρεις περιόδους εισπνοής υπέρτονου διαλύματος χλωριούχου νατρίου διάρκειας 7 min ή μετά από πτώση του FEV1 >20% από την αρχική τιμή του ασθενούς.

Επεξεργασία πτυέλων

Το πτύελο επεξεργαζόταν μέσα σε 15 min από τον τερματισμό της διαδικασίας της πρόκλησης. Στη συνέχεια τα βύσματα βλέννης απομακρύνθηκαν από το πτύελο ακολουθώντας συγκεκριμένο πρωτόκολλο10. Μετρήθηκε το βάρος των βυσμάτων και προστέθηκε διθεϊοθρεϊτόλη 0.1% (Sputolysin, Calbiochem, La Jolla, CA, USA) διπλάσιου βάρους από το βάρος των βυσμάτων. Τα δείγματα ανακινήθηκαν σε αναμικτήρα μέσα σε ένα ευρύ πλαστικό δοκιμαστικό σωλήνα και τοποθετήθηκαν σε ανακινούμενο υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37°C για 15 min ώστε να εξασφαλιστεί πλήρης ομογενοποίηση. Μετά την πλήρη τους ομογενοποίηση προστέθηκε καλλιεργητικό διάλυμα (R.P.M.I.-1640) και 10% F.C.S. (Fetal calf serum) όγκου διπλάσιο από τον όγκο του ομογενοποιημένου δείγματος. Στη συνέχεια τα δείγματα διηθήθηκαν μέσω ενός νάιλον φίλτρου με διάμετρο πόρων 48μm (Thompson, Ontario, Canada) και ανακινήθηκαν σε αναμικτήρα. Στο φιλτραρισμένο δείγμα μετρήθηκε ο ολικός αριθμός κυττάρων και ελέγχθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με τη μέθοδο αποκλεισμού με Trypan Blue. Στη συνέχεια το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 400g για 5min και το ίζημα επαναδιαλύθηκε με 500μl R.P.M.I. - 1640 και 10% F.C.S. Το υπερκείμενο αναρροφήθηκε και αποθηκεύθηκε σε σωληνάρια Eppendorf στους - 80°C.

Τα κύτταρα αραιώθηκαν σε συγκέντρωση 0,35x106 κύτταρα/ml. Aκολούθησε φυγοκέντρηση χρησιμοποιώντας 50μl του εναιωρήματος των κυττάρων τα οποία τοποθετήθηκαν στους υποδοχείς κυτταροφυγόκεντρου (Aerospray, Wescor, Utah, USA) στις 3000 στροφές με βραδεία επιβράδυνση για 5 min. Ακολούθησε χρώση σε δύο αντικειμενοφόρες πλάκες με May - Grunwald/Giemsa (Μ.G.G.) για προσδιορισμό του κυτταρικού τύπου. Στη συνέχεια μετρήθηκαν 500 μη πλακώδη κύτταρα από κάθε δείγμα με τυφλό τρόπο από δύο παρατηρητές. Ο μέσος όρος των δύο υπολογισμών χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του απόλυτου αριθμού κυττάρων ανά γραμμάριο του αρχικού εναιωρήματος πτυέλων.

Απομόνωση των λεμφοκυττάρων από τα πτύελα

Μετά την παραπάνω διαδικασία το ίζημα των κυττάρων επαναδιαλύθηκε σε R.P.M.I.-1640 και 10% F.C.S. ενισχυμένο με 100U/ml πενικιλίνης, 100 mg/ml στρεπτομυκίνη και 0,02mg/ml φλουκοναζόλη. Στη συνέχεια τα λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα κλιμακούμενης πυκνότητας (Lymphoprep), (Nycomed, Oslo). Τα λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν τοποθετήθηκαν σε πινακίδια 24 βοθρίων σε συγκέντρωση 2x106 κύτταρα/ml και διεγέρθηκαν επί 5 ώρες στους 37°C υπό 5% CO2, μέσα σε R.P.M.I-1640 και 10% F.C.S. παρουσία phorbol 12-myristate 13-acetate (P.M.A.) 25ng/ml, ionomycin 1μmole/ml και brefeldin A 10μg/ml (Sigma). Στη συνέχεια τα λεμφοκύτταρα φυγοκεντρήθηκαν σε κυτταροφυγόκεντρο, το ίζημα στέγνωσε στον αέρα και φυλάχτηκε στους - 80°C.

Ανοσοκυτταροχημική ανάλυση

Μέτρηση των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων

Ο προσδιορισμός των CD3+, CD4+ και CD8+ λεμφοκύτταρων έγινε με ανοσοκυτταροχημεία11. Μετά την απόψυξή τους, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε ακετόνη για 10 λεπτά, επανυδατώθηκαν με P.B.S (phosphate buffer saline) και επεξεργάστηκαν για χρώση12. Τα anti-CD3, anti-CD4 (Caltag) "αντι-ανθρώπινα" μονοκλωνικά αντισώματα από ποντίκι και το anti-mouse IgG-F.I.T.C [ανοσοσφαιρίνη έναντι της IgG ποντικιού σημασμένη με F.I.T.C. (fluoroisothiocyanate)] αντίσωμα από κουνέλι χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανίχνευση της περφορίνης

Α) Σήμανση των κυττάρων

Η έκφραση της περφορίνης των κυτταροτοξικών CD8+ κύτταρων ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα παρακάτω "αντι-ανθρώπινα" μονοκλωνικά αντισώματα από ποντίκι, χρησιμοποιήθηκαν για τη σήμανση των κυττάρων: anti-CD3-PCy5, anti-CD8-(PE) και anti-perforin-F.I.T.C. (Serotec). Χρησιμοποιήθηκαν επίσης και μη σημασμένα anti-human-perforin αντισώματα για την ενδοκυττάρια ανίχνευση της περφορίνης. Επίσης anti-mouse αντισώματα από ποντίκι, ισοτυπικά ανάλογα με τα F.I.T.C-, PE-, PCy-5 συζευγμένα αντισώματα, χρησιμοποιήθηκαν σαν αντισώματα ελέγχου.

Για την ενδοκυττάρια σήμανση της περφορίνης, τα CD8+ λεμφοκύτταρα (500.000 κύτταρα) ξεπλύθηκαν με P.B.S και 10% F.C.S. και επωάσθηκαν με anti-CD8-PE για 30 λεπτά στους 4°C. Μετά από διπλό ξέπλυμα με P.B.S/F.C.S τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με το "kit" μονιμοποίησης Intraprep (Beckman-Coulter) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, τα σημασμένα αντισώματα κατά της περφορίνης χρησιμοποιήθηκαν σε μοριακή περίσσεια ως μονάδες ελέγχου, προστέθηκε anti-perforin-F.I.T.C. χωρίς ξέπλυμα και έγινε επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου13. Μετά τη χρώση όλα τα δείγματα ξεπλύθηκαν με διάλυμα P.B.S. και F.C.S., το ίζημα επαναδιαλύθηκε με 1000 μl διαλύματος παραφορμαλδεύδης 2% και τα δείγματα φυλάχτηκαν στους 4° C μέχρι την ανάλυσή τους.

Β) Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

Τα δείγματα (λεμφοκύτταρα πτυέλου) που προετοιμάστηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω, αναλύθηκαν σε κυτταρομετρητή ροής EPICS ELITE. Τουλάχιστον 100.000 κύτταρα αναλύθηκαν σε κάθε περίπτωση. Το κατάλληλο σήμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε για απόσβεση του φόντου. Τα ποσοστά μονοχρωματικών, διχρωματικών και τριχρωματικών κυττάρων και η σχετική ένταση του φωσφορισμού (Relative Fluorescence Intensity-R.F.I.) που αντιστοιχούσε στην πυκνότητα του αντιγόνου, υπολογίστηκαν (Εικόνες 3, 4).

Προσδιορισμός της κυτταροτοξικής δραστηριότητας των CD8+ λεμφοκυττάρων

Προκειμένου να αναγνωρίσουμε εάν τα CD8+ κύτταρα είναι λειτουργικά ικανά να αναγνωρίσουν καρκινικά κύτταρα και να δράσουν σαν κυτταροτοξικά κύτταρα εφαρμόσαμε τεχνικές κυτταροτοξικότητας. Τα κύτταρα στόχοι (Κ562) επωάσθηκαν μαζί με τα λεμφοκύτταρα σε αναλογίες 3/1 έως 50/1 για χρονικό διάστημα τεσσάρων ωρών και σε θερμοκρασία 37°C. Η κυτταροτοξικότητα καθορίστηκε σύμφωνα με προτυποποιημένη μέθοδο.

Στατιστική ανάλυση

Τα κλινικά χαρακτηριστικά παρουσιάζονται ως μέση τιμή ενώ τα κυτταρικά ως διάμεσος (μέγιστος-ελάχιστος). Οι διαφορές ανάμεσα στις τρεις ομάδες των ατόμων της μελέτης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Kruskal Wallis με συγκρίσεις ανά ζεύγη (Posthoc ανάλυση) που έγιναν με τη μέθοδο Conover-Inman. H σχέση ανάμεσα στις κυτταρικές και φυσιολογικές μεταβλητές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το συντελεστή συσχέτισης του Sperman. Tο στατιστικό λογισμικό StartsDirect χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις. Τιμή p < 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Τα δημογραφικά και σπιρομετρικά χαρακτηριστικά των ατόμων φαίνονται στον πίνακα 1. Οι ασθενείς με Χ.Α.Π. είχαν απόφραξη των αεραγωγών, όπως φαίνεται από τη στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη τιμή του δυναμικά εκπνεόμενου όγκου αέρα στο πρώτο δευτερόλεπτο [ F.E.V1 (ως % του προβλεπόμενου)], σε σχέση με τις ομάδες των ατόμων χωρίς Χ.Α.Π. (p < 0,01), (πίνακας 1). Η κυτταρική σύνθεση του πτυέλου παρουσιάζεται στον πίνακα 2.

Υποπληθυσμοί των λεμφοκυττάρων στο πτύελο

Τα ποσοστά και οι απόλυτοι αριθμοί των CD8+ λεμφοκυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με Χ.Α.Π. σε σχέση τόσο με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. όσο και με τους υγιείς μη καπνιστές (πίνακας 3). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των καπνιστών χωρίς Χ.Α.Π. και των υγιών μη καπνιστών όσον αφορά το ποσοστό και τον απόλυτο αριθμό των CD8+ κυττάρων (πίνακας 3). Σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά CD4+ κυττάρων βρέθηκαν στους ασθενείς με Χ.Α.Π. σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. (p = 0,0001) και τους υγιείς μη καπνιστές (p = 0,0001), (πίνακας 3). Αντιθέτως, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στα CD4+ κύτταρα ανάμεσα στους καπνιστές χωρίς νόσο και τους υγιείς μη καπνιστές. Οι ασθενείς με Χ.Α.Π. είχαν σημαντικά χαμηλότερο λόγο CD4+/CD8+ σε σχέση είτε με τους καπνιστές χωρίς περιορισμό της ροής του αέρα (p = 0,001), είτε με τους υγιείς μη καπνιστές (p=0,008), (πίνακας 3). Αντιθέτως, ο λόγος CD4+/CD8+ δεν διέφερε μεταξύ καπνιστών χωρίς Χ.Α.Π. και υγιών μη καπνιστών, (πίνακας 3).

Έκφραση περφορίνης και κυτταροτοξικότητα των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων

Η έκφραση της περφορίνης, εκφραζόμενη ως σχετική ένταση του φωσφορισμού (Relative fluorescence intensity-R.F.I), ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη στους καπνιστές με Χ.Α.Π. σε σχέση με τους καπνιστές χωρίς νόσο, [διάμεσος,(ελάχιστος-μέγιστος)] [6,8(5,7-8,2)] έναντι [4,9(2-6,5)], (p=0,0001) και τους υγιείς μη καπνιστές [2,85(2-4,1)], (p=0,0001). Επίσης η έκφραση της περφορίνης ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη στους καπνιστές χωρίς περιορισμό της ροής του αέρα [4,9 (2-6,5)] σε σχέση με τους υγιείς [2,85(2- 4,1)], (p=0,0001). (Εικόνες 1, 3, 4).

Η κυτταροτοξικότητα (%) των CD8+ λεμφοκυττάρων βρέθηκε να είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερη στους καπνιστές με Χ.Α.Π. σε σχέση είτε με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. [διάμεσος, (ελάχιστος-μέγιστος)] [38(12-48)] έναντι [18(11-36)], (p=0,001), και τους μη καπνιστές υγιείς [8(5-15)], p=0,001. Το ίδιο βρέθηκε να ισχύει όσον αφορά τη σχέση μεταξύ καπνιστών χωρίς Χ.Α.Π. [18(11-36)] και υγιών μη καπνιστών [8 (5-15)], p=0,001 (Εικόνα 2).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι το κάπνισμα είναι η κύρια αιτία της φλεγμονώδους διαδικασίας που χαρακτηρίζει τη χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια14-19. Παρόλα αυτά μόνο το 15% των καπνιστών αναπτύσσουν κλινικά σημαντική νόσο20. Διαφορές στην κυτταρική σύνθεση ανάμεσα στους καπνιστές που αναπτύσσουν Χ.Α.Π. και σε αυτούς που δεν αναπτύσσουν τη νόσο έχουν αναφερθεί σε βρογχικές βιοψίες και στο βρογχικό έκπλυμα 6,7. Από τις μελέτες αυτές γίνεται εμφανές ότι τα κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (CD8+) θα μπορούσαν να έχουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της νόσου.

Χρησιμοποιήσαμε τη διαδικασία της πρόκλησης πτυέλου για να ερευνήσουμε τις διαφορές στις κυτταρικές παραμέτρους σε ασθενείς με Χ.Α.Π. και να τις συγκρίνουμε με αυτές σε καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. και υγιείς μη καπνιστές (πίνακας 2). Ιδιαίτερα μελετήσαμε τα κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα (CD8+), την έκφραση της περφορίνης τους και την κυτταροτοξική τους δραστηριότητα στις τρεις ομάδες. Τα ευρήματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι η πρόκληση πτυέλου αποτελεί μια μη επεμβατική, ασφαλή μέθοδο, που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη μελέτη της φλεγμονής των αεραγωγών που χαρακτηρίζει τη νόσο. Τα αποτελέσματα μας επίσης έδειξαν ότι οι ασθενείς με Χ.Α.Π. παρουσιάζουν μεγαλύτερη κυτταροβρίθεια CD8+ λεμφοκυττάρων, σε σχέση με τις άλλες δύο ομάδες της μελέτης. Βρέθηκε επίσης ότι η κυτταροτοξική δραστηριότητα των CD8+ κυττάρων ήταν μεγαλύτερη στους καπνιστές με Χ.Α.Π. Το ίδιο παρατηρήθηκε και στην περίπτωση της έκφρασης της περφορίνης.

Το ποσοστό και ο απόλυτος αριθμός των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων στο πτύελο στους καπνιστές με Χ.Α.Π. ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. και τους υγιείς μη καπνιστές (πίνακας 3). Περίπου το 50% των λεμφοκυττάρων στο πτύελο ασθενών με Χ.Α.Π. ήταν κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (CD8+). Τα αποτελέσματα μας είναι σε συμφωνία με ήδη γνωστές μελέτες σε βιοψίες βρόγχου, επισημαίνοντας τη συμβολή των παραπάνω κυττάρων στην παθογένεια της νόσου6,7. Επιπλέον, ο λόγος των κυττάρων CD4+/CD8+ βρέθηκε να είναι στατιστικά σημαντικά χαμηλότερος σε ασθενείς με Χ.Α.Π, σε σύγκριση με τους καπνιστές χωρίς περιορισμό της ροής του αέρα και τους υγιείς μη καπνιστές. Η αναλογία CD4+/CD8+ δε διέφερε ανάμεσα στους καπνιστές χωρίς Χ.Α.Π. και τους υγιείς μη καπνιστές. Τα παραπάνω ευρήματα δείχνουν ότι η παθολογική φλεγμονώδη διεργασία που χαρακτηρίζει τη χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα μιας διαταραχής της ισορροπίας ανάμεσα στα κυτταροτοξικά CD8+ και τα CD4+ λεμφοκύτταρα.

Επιπλέον μελετήσαμε την κυτταροτοξική δραστηριότητα των CD8+ λεμφοκυττάρων επωάζοντας τα με καρκινικά κύτταρα. Βρέθηκε ότι τα CD8+ λεμφοκύτταρα στους καπνιστές με Χ.Α.Π, είναι περισσότερο κυτταροτοξικά σε σχέση με εκείνα των καπνιστών χωρίς αποφρακτική συνδρομή και των υγιών μη καπνιστών. Τα CD8+ λεμφοκύτταρα εκφράζουν έντονη κυτταροτοξική δραστηριότητα στους καπνιστές με Χ.Α.Π, η οποία φαίνεται να συμβάλλει αρχικά στην άμυνα έναντι των ιογενών λοιμώξεων. Οι μελέτες της "αντιϊκής" δραστηριότητας των CD8+ κυττάρων δείχνουν ότι η κυτταρολυτική αυτή δραστηριότητα είναι αναγκαία και ικανή για τη λύση των ιογενών μολυσμένων κυττάρων στόχων20. Σε μια πρόσφατη ανασκόπηση η Saetta και οι συνεργάτες της αναφέρουν ότι η άθροιση των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων που παρατηρείται στη Χ.Α.Π. θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα της απάντησης σε ένα αυτοαντιγονικό ερέθισμα που προκαλείται από το κάπνισμα και όχι απαραίτητα απάντηση σε ιογενή λοίμωξη20.

Για να ερευνήσουμε περαιτέρω την κατάσταση της δραστηριότητας των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων στα πτύελα των καπνιστών με Χ.Α.Π. μελετήσαμε την έκφραση της περφορίνης σε αυτά τα κύτταρα. Η έκφραση της περφορίνης προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής και εκφράστηκε ως σχετική ένταση φθορισμού (R.F.I= Relative Fluorescence Intensity). Τα ευρήματα μας δείχνουν ότι η έκφραση της περφορίνης των κυτταροτοξικών CD8+ λεμφοκυττάρων στους καπνιστές με νόσο ήταν μεγαλύτερη συγκριτικά με εκείνους χωρίς Χ.Α.Π. και τους υγιείς μη καπνιστές. Η αυξημένη έκφραση περφορίνης που παρατηρήθηκε στους καπνιστές με Χ.Α.Π. αποτελεί ένα ισχυρό στοιχείο ότι τα CD8+ κύτταρα είναι ενεργοποιημένα σε αυτούς. Είναι γνωστό ότι τα ενεργοποιημένα κυτταροτοξικά CD8+ λεμφοκύτταρα προκαλούν βλάβη του κυψελιδικού επιθηλίου μέσω απελευθέρωσης περφορίνης και άλλων πρωτεολυτικών ενζύμων καθώς και μέσω της έκκρισης του παράγοντα νέκρωσης όγκου (ΤNF-α)21,22. Ο παραπάνω μηχανισμός θα μπορούσε να ερμηνεύσει τον τρόπο δράσης των CD8+ λεμφοκυττάρων στην παθογένεια της νόσου.

Η παρουσία ενεργοποιημένων CD8+ κυττάρων στα μεσοδιαστήματα των εξάρσεων σε ασθενείς με Χ.Α.Π, υποδηλώνει ότι αυτά δεν αντιδρούν μόνο σε ένα λοιμογόνο παράγοντα, αλλά ίσως και σε ενδογενή ερεθίσματα20. Το κάπνισμα φαίνεται ότι δεν αποτελεί το μόνο ερέθισμα που διεγείρει τα κυτταροτοξικά CD8+ λεμφοκύτταρα. Ίσως άλλα απροσδιόριστα ερεθίσματα ή γενετικοί παράγοντες ευθύνονται για την "υπερανταπόκριση" των CD8+ κυττάρων στη φλεγμονή που χαρακτηρίζει τη νόσο. Τα ευρήματά μας δείχνουν μια διαφορετική φλεγμονώδη ανταπόκριση στο κάπνισμα τόσο στο επίπεδο της κυτταροτοξικής δραστηριότητας των CD8+ λεμφοκυττάρων, όσο και στο επίπεδο της έκφρασης της περφορίνης μεταξύ καπνιστών με Χ.Α.Π., καπνιστών χωρίς περιορισμό της ροής του αέρα και υγιών μη καπνιστών. Απαιτείται όμως περαιτέρω έρευνα για τη διευκρίνιση του μηχανισμού δράσης των κυτταροτοξικών CD8+ στην παθογένεια της νόσου.


ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

  1.  Romain A, Pauwels A, Sonia Buist, Peter M.A. Calverley et al. On behalf of the GOLD Scientific Committee Global. Strategy for the diagnosis, management and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLI/WHO Global initiative for chronic obstructive lung disease (GOLD) Workshop Summary. Am J Respir Crit Care Med 1256-1276, 2001.

  2.  Siafakas NM, Vermiere P, Pride NB, et al. On behalf of the Task Force. Optimal assessment and management of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Eur Respir J 1995; 8:1398-1420.

  3.  Keatings VM, Collins PD, Scott DM, Barnes PJ. Differences in interleukine-8 and tumor necrosis factor-alpha in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma. Am J Respir Crit Care Med 1996; 153:530-534.

  4.  Pesci A, Balbi B, Majori M, Cacciani G, Bertacco S, Alciato P, Donner CF. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J 1998;12:380-386.

  5.  Yamamoto C, Yoneda T, Yoshikawa M, Fu A, Tokyama T, Tsukaguchi K, Narita N. Airway inflammation in COPD assessed by sputum levels of interleukin-8. Chest 1997; 112:505-510.

  6.  O'Shaughnessy TC, Ansari TW, Barnes NC, Jeffery PK. Inflammation in bronchial biopsies of subjects with chronic bronchitis: inverse relationship of CD8+ T-lymphocytes with FEV1. Am J Respir Crit Care Med 1997; 155:852-857.

  7.  Sate M, Di Stefano A, Turato G, Facchini FM, Corbino L, Mapp CE, Maestrelli P, Ciaccia A, Fabri LM. CD8+ lymphocytes in the peripheral airways of smokers with both symptoms of chronic bronchitis and airflow limitation.

  8.  Ning Liu A, Mohammed AZ, Ward R, Rice, Fiedeldey DT, Liebermann JS et al. Perforin -Independent CD8+ T-Cell-Mediated Cytotoxicity of Alxeolar Epithelial Cells Is preferentially mediated by tumor necrosis factor-α Relative Insensitivity to Fas Ligand. Am J Respir Cell Mol Biol Vol 20, pp. 849-858, 1999.

  9.  Quanjer PH, Tammeling GJ, Cotes JE, Fabbri LM, Matthys H, Pedersen OF, Peslin R, Roca J, et al. Symbols, abbreviations and units. Working Party Standardization of Lung Function Tests, European Community of Steel and Coal. Eur Respir J Suppl 1993 Mar; 16:85-100.

10.  Kips JC, Fahy JV, Hargreave FE, Ind PW, In't veen JC. Methods for sputum induction and analysis of induced sputum: a method for assessing airway inflammation in asthma.

11.  Kyriakou D, Karkavitsas N, Eliopoulos G, Spandidos DA. Immunohistochemical analysis of the ras p12 oncoprotein in Hashimoto's thyroiditis. Anticancer Res 1992 12(4):1189-94.

12.  Ito N, Nakamura H, Tanaka Y, Ohgi S. Lung carcinoma: analysis of T helper type 1 and 2 cells and T cytotoxic type 1 and 2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry. Cancer 1999 1; 85(11): 2359-67.

13.  Vukmanovic-Stejic M, Gorak-Stolinska P, Noble A, Kemeny DM. Human Tc1 and Tc2/Tc0 CD8 T-cells clones display distinct cell surface and functional phenotypes. Blood 2000 1; 95(1): 231-40.

14.  Jeffery PK. Morphology of the airway wall in asthma and in chronic obstructive pulmonary disease. Am Rev Respir Dis 143:1152-1158.

15.  Mullen JBM, Wright B, Wiggs PD, Pare and JC Hogg. Reassessment of inflammation of airways in chronic bronchitis. Br Med J 291:1235-1239.

16.  Niewoehner DE, Klienerman J, D. Rice. Pathological changes in the peripheral airways of young cigarette smokers. N Eng J Med 1974; 291:755-758.

17.  Diener, C.F and B.Burrows. Further observations on the course and the prognosis of chronic obstructive pulmonary disease. Am Rev Respir Dis 1975; 111:719-724.

18.  Dool R, Peto R. Mortality in relation to smoking: 20 years observation on British made doctors. BMJ 1976; 2:1525-1535.

19.  Fletcher C, Peto R. The natural history of chronic airflow obstruction. BMJ 1976; 2:1525-1535.

20.  M.Saetta G, Turrato P, Maestrelli CE, Mapp and LM Fabbri. Cellular and structural bases of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med Vol 163. pp 1304-1309,2001.

21.  Lichtenheld MG, Olsen KJ, Lu P, Lowrey DM, Hameed A, Hengartner H, and Podack ER. Structure and function of human perforin. Nature 1988; 355:448-451.

22.  Nakata M, Kawasaki A, Azuma M, Tsuji K, Matsuda H, Shinkai Y, Yagita H, Okumura K. Expression of perforin and cytolytic potential of human peripheral blood lymphocyte subpopulations. Int Immunol 1992; 1049-1054.

© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE