Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα: Μια νέα μη επεμβατική μέθοδος για την εκτίμηση της φλεγμονής των αεραγωγών
ΠΕΡΙΛΗΨΗ. Η φλεγμονή των αεραγωγών παίζει κεντρικό ρόλο σε νοσήματα όπως το άσθμα και η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια. Η εφαρμογή μη επεμβατικών τεχνικών για την εκτίμηση αυτής της φλεγμονής αποτελεί αντικείμενο αυξανόμενου ενδιαφέροντος κατά τα τελευταία έτη. Η συλλογή του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα επιτυγχάνεται μετά από ψύξη του με ειδικές διατάξεις και παρέχει πολύτιμες πληροφορίες για περιοχές του αναπνευστικού που παλαιότερα ήταν προσπελάσιμες μόνο επεμβατικά. Στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα έχουν προσδιοριστεί μέχρι σήμερα μόρια όπως υπεροξείδιο του υδρογόνου, 8-ισοπροστάνιο, τελικά προϊόντα μεταβολισμού του NO (νιτρικά/νιτρώδη, νιτροτυροσίνη), λευκοτριένια και πρόσφατα το pH του. Η κλινική εφαρμογή αυτών των μετρήσεων αφορά πολλές από τις φλεγμονώδεις παθήσεις του αναπνευστικού, όπως είναι το άσθμα, η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, η κυστική ίνωση, οι βρογχεκτασίες και το ARDS. Παρά τα μεθοδολογικά προβλήματα που παρουσιάζει ακόμη η μέθοδος, ο μη επεμβατικός της χαρακτήρας, που δίνει τη δυνατότητα επαναλαμβανόμενων μετρήσεων στο ίδιο άτομο και οι πολύτιμες πληροφορίες που έχουν συγκεντρωθεί με την εφαρμογή της, την καθιστούν χρήσιμο μέσο για τη μελέτη της φλεγμονής των αεραγωγών. Πνεύμων 2001, 14(3)184-196.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η φλεγμονή των αεραγωγών παίζει κεντρικό ρόλο σε νοσήματα όπως το άσθμα και η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ). Η εκτίμηση αυτής της φλεγμονής είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη διερεύνηση των βασικών παθογενετικών μηχανισμών κάποιων νοσημάτων, ενώ και ο ρόλος της στην εμφάνιση παροξύνσεων και στην πρόκληση χρόνιων δομικών μεταβολών στους αεραγωγούς είναι ιδιαίτερα σημαντικός. Επιπλέον, είναι πιθανό ότι η αξιολόγηση της φλεγμονής θα δώσει τη δυνατότητα διάγνωσης χρόνιων παθήσεων των αεραγωγών που δεν αποκαλύπτονται με την κλινική εξέταση, τις λειτουργικές δοκιμασίες των πνευμόνων ή με τον έλεγχο της βρογχικής υπεραντιδραστικότητας. Η εκτίμηση της φλεγμονής των αεραγωγών γινόταν μέχρι πρόσφατα αποκλειστικά με επεμβατικές τεχνικές, όπως είναι το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL), η ενδοβρογχική και η διαβρογχική βιοψία, υλικά που λαμβάνονται βρογχοσκοπικά. Ωστόσο, τέτοιες τεχνικές έχουν αυξημένους κινδύνους επιπλοκών και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διαδοχικές μετρήσεις στον ίδιο ασθενή. Κατά τα τελευταία χρόνια, η έρευνα έχει επικεντρωθεί σε λιγότερο επεμβατικές τεχνικές, όπως είναι η προκλητή απόχρεμψη1 και η μέτρηση δεικτών στον εκπνεόμενο αέρα (με κυριότερο το εκπνεόμενο μονοξείδιο του αζώτου [NO]) και στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα.

Το ενδιαφέρον για την αξιοποίηση του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα (exhaled ή expired breath condensate) άρχισε στα μέσα της δεκαετίας του 1980, με τη μελέτη του σε ασθενείς που νοσηλεύονταν διασωληνωμένοι υπό μηχανική υποστήριξη της αναπνοής στη Μονάδα Εντατικής Θεραπείας2. Από τότε, ιδιαίτερα μετά τα μέσα της δεκαετίας του 1990, αυξάνεται διαρκώς το ενδιαφέρον για τη νέα αυτή μη επεμβατική τεχνική και τις πιθανές προοπτικές αξιοποίησής της στη μελέτη της φλεγμονής των αεραγωγών.

ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΤΟ ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΑ ΤΟΥ ΕΚΠΝΕΟΜΕΝΟΥ ΑΕΡΑ

Ο αέρας στους βρόγχους και τις κυψελίδες είναι κορεσμένος με υδρατμούς σε ποσοστό 100% και έχει θερμοκρασία 37°C, ανεξάρτητα από την υγρασία και τη θερμοκρασία του εισπνεόμενου μίγματος αέρα3. Με βάση την παρατήρηση αυτή, η ψύξη του εκπνεόμενου αέρα θα επιφέρει υγροποίηση των υδρατμών. Οι υδρατμοί αυτοί συμπαρασύρουν διάφορα πτητικά και μη μόρια, με μέγεθος <65 kDa, που προέρχονται από το κατώτερο αναπνευστικό4. Η συλλογή του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα στοχεύει στη μελέτη αυτών των μορίων, από τα οποία είναι δυνατόν να αντληθούν πολύτιμες πληροφορίες για θέσεις του αναπνευστικού που είναι προσπελάσιμες μόνο επεμβατικά.

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ

Το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα συλλέγεται σήμερα με δύο κυρίως τεχνικές, που εφαρμόζονται σε διάφορα κέντρα με κάποιες παραλλαγές. Και στις δύο τεχνικές η αρχική προετοιμασία είναι η ίδια. Ο εξεταζόμενος ξεπλένει καλά το στόμα και το στοματοφάρυγγά του με νερό και κατόπιν αναπνέει ήρεμα και σταθερά (tidal breathing) μέσα σε ένα επιστόμιο για 10-15 λεπτά, με τη μύτη του κλειστή με ένα ρινικό πίεστρο. Στο επιστόμιο υπάρχει μια βαλβίδα διπλής κατεύθυνσης (τύπου Heins-Rudolph), με την οποία επιτυγχάνεται διαχωρισμός της εισπνοής από την εκπνοή. Και με τους δύο τρόπους επιδιώκεται η συλλογή τουλάχιστον 1 ml συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα, το οποίο συνήθως καταψύχεται άμεσα (κατά κανόνα στους –70° C) προκειμένου να εξεταστεί σε δεύτερο χρόνο. Οι δύο τεχνικές διαφέρουν αποκλειστικά στον τρόπο συλλογής του συμπυκνώματος.

Στην πρώτη τεχνική5, το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα συλλέγεται μέσα σε ένα γυάλινο δοχείο με δύο χώρους. Στον εσωτερικό χώρο τοποθετείται πάγος ενώ ο αέρας που εκπνέεται από τον εξεταζόμενο διέρχεται από τον εξωτερικό. Το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα παράγεται στην ψυχρή εξωτερική επιφάνεια του εσωτερικού δοχείου και συλλέγεται στο κατώτερο τμήμα του εξωτερικού χώρου της διάταξης καθ’ όλη τη διάρκεια της διαδικασίας. Σε άλλα κέντρα εφαρμόζεται μια περισσότερο σύνθετη τεχνική με τη χρήση ξηρού πάγου6.

Στη δεύτερη τεχνική, που χρησιμοποιείται και στην Κλινική μας7, ο εκπνεόμενος αέρας ψύχεται με την εφαρμογή ψυχρού αέρα. Το μηχάνημα που χρησιμοποιείται για την πρόκληση με ψυχρό αέρα χρησιμοποιείται για την παραγωγή ψυχρού αέρα σε θερμοκρασίες από –15° C έως –18°C με ροή 80 l/λεπτό. Η συλλογή του συμπυκνώματος γίνεται με ένα γυάλινο σωλήνα διπλού αυλού μήκους 30 cm. Το ένα στόμιο του εξωτερικού αυλού συνδέεται με το σημείο εξόδου του ψυχρού αέρα και ο αέρας αυτός απομακρύνεται από το άλλο άκρο αυτού του αυλού. Στο ένα στόμιο του εσωτερικού αυλού εκπνέει ο εξεταζόμενος μέσω της βαλβίδας τύπου Heins-Rudolph. Στην περίπτωση αυτή το συμπύκνωμα παράγεται στον εσωτερικό αυλό και συλλέγεται σε ειδική διάταξη που βρίσκεται στο αντίθετο από τον ασθενή άκρο.

Η μέθοδος που χρησιμοποιούμε στην Κλινική μας πλεονεκτεί έναντι της πρώτης μεθόδου στα ακόλουθα: (1) Με τη μέθοδο του ψυχρού αέρα αποφεύγεται εντελώς η ανάμειξη με σίελο, καθώς η συλλογή γίνεται στο περιφερικό άκρο του σωλήνα που βρίσκεται 30 cm μακριά από το στόμα του ασθενούς και (2) η θερμοκρασία ψύξεως του δείγματος μέσω του μηχανήματος του ψυχρού αέρα είναι σταθερή, κάτι που δεν είναι εφικτό με την πρώτη μέθοδο, όπου στη διαδικασία ο πάγος τήκεται, με αποτέλεσμα τη μεταβολή της θερμοκρασίας.

Σε όλες τις μετρήσεις γίνεται προσδιορισμός της αμυλάσης στο δείγμα, προκειμένου να αποκλειστεί η πρόσμιξη με σίελο. Στο σίελο περιέχονται ποσότητες οξειδωτικών ουσιών, γεγονός που θα μπορούσε να οδηγήσει σε λανθασμένα αποτελέσματα. Η τεχνική αυτή δεν εφαρμόστηκε στις αρχικές μελέτες, αλλά αποτελεί σήμερα απαραίτητη προϋπόθεση για την αξιοπιστία της μεθόδου.

ΤΙ ΜΕΤΡΑΤΑΙ ΣΤΟ ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΑ ΤΟΥ ΕΚΠΝΕΟΜΕΝΟΥ ΑΕΡΑ;

Ένα μεγάλο ερώτημα που δεν έχει απαντηθεί ακόμη σε όλη του την έκταση σήμερα είναι το ποια μόρια μπορούν να ανιχνευθούν στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Τα πτητικά μόρια είναι εκείνα που ανιχνεύονται ευκολότερα, αλλά υπάρχουν αναφορές προσδιορισμού μη πτητικών μορίων. Στη συνέχεια θα εξεταστούν μερικά από τα μόρια που έχουν ανιχνευθεί μέχρι σήμερα στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), το 8-ισοπροστάνιο και τα προϊόντα του μεταβολισμού του NO (νιτρικά-νιτρώδη, νιτροτυροσίνη). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης ο προσδιορισμός του pH του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα.

1. Υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2)

Οι κλασικές βιβλιογραφικές αναφορές είναι εκείνες που σχετίζονται με την εκτίμηση της οξειδωτικής φλεγμονής μέσω του προσδιορισμού του H2O2, αρχικά σε ασθενείς με ARDS2 και οξεία αναπνευστική ανεπάρκεια6,8 και κατόπιν σε ασθενείς με βρογχικό άσθμα9-12, ΧΑΠ13,14, βρογχεκτασίες15 και κυστική ίνωση16. Το H2O2 μετρήθηκε επίσης στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα υγιών καπνιστών17 και καπνιστών με ΧΑΠ18, ενώ καταγράφηκαν και οι φυσιολογικές τιμές του σε υγιή παιδιά19. Οι μέθοδοι μέτρησης του υπεροξειδίου του υδρογόνου βασίζονται στην ικανότητά του να αντιδρά με κατάλληλα υποστρώματα, απελευθερώνοντας χρώμα, φως ή φθορισμό. Υπάρχουν, ωστόσο, προβλήματα στη μέτρησή του. Το ποσό που αποβάλλεται από τους φυσιολογικούς ανθρώπους είναι σχεδόν μη ανιχνεύσιμο, ενώ και σε πολλές παθήσεις τα επίπεδά του είναι στα κατώτερα όρια ανίχνευσης των χρησιμοποιούμενων μεθόδων. Ένα άλλο σύνηθες λάθος σχετίζεται με τη συλλογή και την αποθήκευση των δειγμάτων. Το H2O2 είναι ένα πτητικό μόριο, το οποίο αποδομείται στη θερμοκρασία του δωματίου ή όταν έρχεται σε επαφή με μέταλλο. Τα δείγματα θα πρέπει να καταψύχονται ταχύτατα και να αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες κάτω από τους –70° C20. Στη μελέτη των Jobsis και συν. που προσδιόρισε τις φυσιολογικές τιμές σε υγιή παιδιά διαπιστώθηκε ότι τα δείγματα του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα μπορούν να διατηρηθούν για ένα τουλάχιστον μήνα χωρίς μεταβολή της συγκέντρωσης του H2O219, γεγονός που οδήγησε στο συμπέρασμα ότι η μέτρηση είναι επαναλήψιμη και αναπαραγώγιμη.

Ο προσδιορισμός του H2O2 γίνεται κατά κύριο λόγο με τρεις μεθόδους. Στην πρώτη, που περιγράφηκε από τους Gallati και Pracht21, 100 μl συμπυκνώματος αναμιγνύονται με 100 μl διαλύματος 3,3΄, 5,5΄-tetramethylbenzidine (ΤΜΒ) 420 μΜ (διαλελυμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών 0,42 Μ, pH 3,8) και 10 μl διαλύματος υπεροξειδάσης horseradish 52,5 U/ml. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και, κατόπιν, το μίγμα οξεοποιείται σε pH 1 με την προσθήκη 10 μl διαλύματος θειϊκού οξέος 18 Ν. Το προϊόν της αντίδρασης προσδιορίζεται φασματοφωτομετρικά στα 450 nm. Η απορρόφηση είναι ευθέως ανάλογη με τη συγκέντρωση του H2O2. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου είναι περίπου 0,1 μΜ. Η μέθοδος με αυτή τη μορφή της χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τους Dekhuijzen και συν.13. Μια παραλλαγή αυτής της μεθόδου είναι εκείνη που χρησιμοποιήθηκε από τους Antczak και συν.11 και περιγράφηκε από τους Ruch και συν.22, στην οποία προσδιορίζεται φασματοφθορισμομετρικά ένα προϊόν της οξείδωσης του ομοβανιλλικού οξέος (homovanillic acid-HVA) που σχετίζεται άμεσα με τη συγκέντρωση του H2O2. Οι Jobsis και συν.10 χρησιμοποιούν τη μέθοδο των Hyslop και Sklar23 που χρησιμοποιεί το p-υδροξυφαινυλοξικό οξύ ως υπόστρωμα οξείδωσης από το προϊόν της αντίδρασης του H2O2 και της υπεροξειδάσης horseradish και το προϊόν της αντίδρασης προσδιορίζεται φωτομετρικά. Τέλος, οι Russell και συν.24 έχουν προτείνει μια νέα μέθοδο για τον προσδιορισμό του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Η μέθοδος εφαρμόζει μια τεχνική χημειοφωταύγειας με τη χρήση luminol που επιτρέπει την ανίχνευση H2O2 σε συγκεντρώσεις μέχρι 2,5 nΜ.

Στους υγιείς μη καπνιστές, οι τιμές του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα εμφανίζουν σημαντικές διαφορές. Εκείνοι που χρησιμοποιούν την πρώτη μέθοδο (TMB), έχουν ανακοινώσει τιμές 0,029±0,012 και 0,26±0,04 μΜ H2O2 (μέση τιμή ± SEM)13,15. Στη μέθοδο που χρησιμοποιεί το HVA, οι τιμές των φυσιολογικών ατόμων σε τρεις μετρήσεις της ίδιας ομάδας ήταν 0,05±0,11, 0,01±0,03 και 0,05±0,07 μΜ αντίστοιχα11,17,18. Ανάλογα, σε δύο μελέτες των Jobsis και συν. οι μέσες τιμές σε υγιή παιδιά είναι 0,13 και 0,15 μΜ αντίστοιχα, χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ αγοριών και κοριτσιών10,19. Πρέπει να επισημανθεί, ωστόσο, το γεγονός ότι σε πολλούς από τους φυσιολογικούς εξεταζόμενους, το H2O2 ήταν μη ανιχνεύσιμο. Στους υγιείς καπνιστές, ωστόσο, οι τιμές του ήταν πολύ μεγαλύτερες (περίπου πενταπλάσιες, 0,24±0,32 μΜ) από τους υγιείς μη καπνιστές, γεγονός που αντανακλά πιθανώς την παρουσία αυξημένου οξειδωτικού φορτίου στους κατώτερους αεραγωγούς λόγω του καπνίσματος17.

2. 8-ισοπροστάνιο (8-isoprostane)

Τα ισοπροστάνια ή εικοσανοειδή είναι ενώσεις ανάλογες με τις προσταγλανδίνες που παράγονται in vivo από την υπεροξείδωση του αραχιδονικού οξέος που καταλύεται από ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, κυρίως μη ενζυμικά (χωρίς τη συμμετοχή της κυκλοοξυγενάσης)25. Η παραγωγή τους γίνεται in situ στα φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης, από τα οποία διαχωρίζονται με τη δράση της φωσφολιπάσης Α226. Λόγω της σταθερότητάς τους, της ειδικότητάς τους για την υπεροξείδωση των λιπών, της παραγωγής τους in vivo και της σχετικής αφθονίας τους στα βιολογικά υγρά, οι ουσίες αυτές αποτελούν άριστους δείκτες του οξειδωτικού stress27. Η πιο γνωστή ένωση της κατηγορίας των F2-ισοπροστανίων είναι το 8-ισοπροστάνιο (8-isoprostane ή 8-epi-prostaglandin F2a), που αποτελεί το κύριο μέλος της οικογένειας των εικοσανοειδών που μετράται στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα και έχει ισχυρή βιολογική δράση in vivo28,29. Η μέθοδος αναφοράς για τον προσδιορισμό του 8-isoprostane σε βιολογικά υγρά είναι η αέριος χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (gas chromatography-mass spectrometry ή GC-MS), λόγω της μεγάλης της ειδικότητας και ευαισθησίας30. Ωστόσο, η μέθοδος αυτή είναι ιδιαίτερα χρονοβόρα και είναι διαθέσιμη σε λίγα μόνο κέντρα. Έτσι, το 8-isoprostane προσδιορίζεται σήμερα κυρίως με ανοσοχημικές μεθόδους31.

Τα ισοπροστάνια έχουν μελετηθεί σε λίγες μόνο μελέτες ως δείκτες του οξειδωτικού stress των αεραγωγών32,33. Πρόσφατα μετρήθηκε το 8-isoprostane στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) φυσιολογικών ατόμων και ασθενών με διάμεσες πνευμονοπάθειες34. Στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα μετρήθηκε 8-isoprostane σε φυσιολογικά άτομα και σε ασθενείς με βρογχικό άσθμα35, ΧΑΠ36, ARDS37 και κυστική ίνωση38. Οι τιμές που έχουν αναφερθεί στα φυσιολογικά άτομα είναι 15,8±1,6 pg/ml35 και 15,2±1,7 pg/ml38. Στους υγιείς μη καπνιστές οι αντίστοιχες τιμές είναι 10,8±0,8 pg/ml, ενώ στους καπνιστές είναι περίπου διπλάσιες (24,3±2,6 pg/ml)36, εύρημα συμβατό με την αύξηση του οξειδωτικού stress λόγω της υπεροξείδωσης των λιπών που παρατηρείται στους καπνιστές39. Χαρακτηριστικά, οι υγιείς καπνιστές εμφάνιζαν σημαντική αύξηση των συγκεντρώσεων του 8-isoprostane 15 λεπτά μετά το κάπνισμα, κάτι που σημαίνει ότι το κάπνισμα προκαλεί οξεία αύξηση του οξειδωτικού stress των αεραγωγών36.

3. Προϊόντα μεταβολισμού του NO (νιτρικά [NO3]-νιτρώδη [NO2], νιτροτυροσίνη)

Το εκπνεόμενο NO έχει προταθεί ως δείκτης φλεγμονής των αεραγωγών, καθώς βρέθηκε αυξημένο στους ασθματικούς ασθενείς40. Τα επίπεδα του NO θα έπρεπε να είναι αυξημένα σε όλες τις φλεγμονώδεις παθήσεις των αεραγωγών. Ωστόσο, σε ασθενείς με κυστική ίνωση τα επίπεδα του NO βρέθηκαν φυσιολογικά41 ή ελαττωμένα42 σε σχέση με εκείνα των φυσιολογικών ατόμων, ενώ και σε ασθενείς με βρογχεκτασίες δεν βρέθηκαν αυξημένα επίπεδα NO43. Μεταγενέστερες παρατηρήσεις, επίσης, όπως εκείνη των Horvath και συν.44 έδειξαν ότι δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης του NO στον εκπνεόμενο αέρα και του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθματικών ασθενών, ιδιαίτερα σε εκείνους με ασταθή κλινική πορεία Είναι γνωστό ότι το NO είναι ένα ασταθές πτητικό μόριο, που μετατρέπεται ταχύτατα στα μη πτητικά νιτρικά (ΝΟ3) και νιτρώδη (ΝΟ2) και η αντίδραση αυτή επηρεάζεται από τη φλεγμονή των αεραγωγών. Διατυπώθηκε, έτσι, η υπόθεση ότι η μέτρηση των σταθερών τελικών προϊόντων του μεταβολισμού του NO, όπως είναι τα νιτρικά και τα νιτρώδη αποτελεί περισσότερο αξιόπιστο τρόπο έκφρασης της φλεγμονής των αεραγωγών σε καταστάσεις όπως η κυστική ίνωση, καθώς είναι πιθανό ότι το αέριο NO μετατρέπεται σε νιτρικά και νιτρώδη κοντά στη θέση παραγωγής του και για το λόγο αυτό δεν ανιχνεύεται45.

Ο προσδιορισμός των νιτρωδών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα γίνεται με μια χρωματογραφική μέθοδο που βασίζεται στην αντίδραση του Griess46. Συγκεκριμένα, 100 μl συμπυκνώματος αναμιγνύονται με 100 μl αντιδραστηρίου του Griess (υδροχλωρική ναφθυλ-εθυλενδιαμίνη 0,1%, σουλφανιλαμίδη 1%, H3PO4 3%) και μετράται με φωτόμετρο η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος της αντίδρασης στα 570 nm. Οι Nightingale και συν.47,48 μέτρησαν τα νιτρώδη με μια φθορισμομετρική μέθοδο που περιγράφηκε από τους Misko και συν.49 που είναι περισσότερο ευαίσθητη από τη μέθοδο Griess. Σε πρόσφατη μελέτη της Κλινικής μας50, μετρήθηκε στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα το άθροισμα των νιτρωδών και νιτρικών, το σύνολο δηλαδή των τελικών προϊόντων του μεταβολισμού του NO. Για το σκοπό αυτό, τα νιτρικά μετατράπηκαν ενζυμικά σε νιτρώδη με την επίδραση αναγωγάσης των νιτρικών51 και στη συνέχεια μετρήθηκαν τα ολικά νιτρώδη (αναχθέντα νιτρικά + νιτρώδη) με την αντίδραση Griess.

To NO αντιδρά με ανιόντα υπεροξειδίου (O2) στους αεραγωγούς με αποτέλεσμα τη δημιουργία υπεροξειδίου του αζώτου (ONOO), ενός ιδιαίτερα οξειδωτικού μορίου που αντιδρά με κατάλοιπα τυροσίνης από πρωτεϊνικά μόρια δημιουργώντας το σταθερό προϊόν νιτροτυροσίνη. Νιτροτυροσίνη ανιχνεύθηκε με ανοσολογικές μεθόδους σε ιστολογικά παρασκευάσματα από βρογχικές βιοψίες που λήφθηκαν από ασθματικούς ασθενείς52, καθώς και σε νεκροτομικά παρασκευάσματα πνεύμονα ασθενών με βρογχικό άσθμα που κατέληξαν από status asthmaticus ή άλλα αίτια53. Το μόριο αυτό μετρήθηκε πρόσφατα54 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα φυσιολογικών ατόμων και ασθματικών ασθενών. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ανοσοενζυμική μέθοδος.

4. pH

Πρόσφατα προσδιορίστηκε από τους Hunt και συν.55 το pH των αεραγωγών σε φυσιολογικά άτομα και σε ασθματικούς ασθενείς, με βάση την υπόθεση ότι η ενδογενής οξίνιση των αεραγωγών μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στην παθοφυσιολογία του άσθματος. Οι τιμές του pH στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα των φυσιολογικών ατόμων ήταν 7,65±0,20.

5. Άλλα μόρια

Οι ουσίες που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (thiobarbituric acid-reactive substances ή TBARs) είναι πτητικά μόρια που παράγονται από την υπεροξείδωση των λιπών και μπορεί να περιέχονται στον εκπνεόμενο αέρα56. Οι TBARs ανιχνεύτηκαν στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα φυσιολογικών ατόμων, ασθματικών ασθενών11 και ασθενών με ΧΑΠ14. Ο προσδιορισμός τους έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο του Yagi57, που βασίζεται στην ανάμιξη του συμπυκνώματος με διάλυμα θειοβαρβιτουρικού οξέος (thiobarbituric acid-TBA) και στο συνακόλουθο προσδιορισμό των TBAR φασματοφωτομετρικά.

Σε μια από τις πρώτες μελέτες του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα4, αναφέρεται η ανίχνευση πρωτεϊνών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ατόμων με διάφορες παθήσεις του αναπνευστικού, που προέρχονταν, σύμφωνα με τους συγγραφείς, εν μέρει από το κατώτερο αναπνευστικό. Στην ίδια μελέτη αναφέρεται επίσης η ανίχνευση μορίων όπως η ιντερλευκίνη-1β (IL-1β), και ο νεκρωτικός παράγοντας των όγκων-α (tumor necrosis factor-α ή TNF-α), με ανοσοενζυμικές και ραδιοανοσολογικές μεθόδους αντίστοιχα. Στη μελέτη αυτή δεν ήταν δυνατός ο προσδιορισμός ιντερλευκίνης-6 (IL-6). Οι Cunningham και συν.58 ανίχνευσαν ιντερλευκίνη-8 (IL-8) στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα παιδιών με κυστική ίνωση με την εφαρμογή μιας ανοσο-προσροφητικής μεθόδου. Τέλος, πρόσφατα ανιχνεύτηκαν λευκοτριένια (LTB4, LTC4, LTD4, LTE4) στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα φυσιολογικών ατόμων και ασθματικών ασθενών με ανοσοενζυμικές μεθόδους54.

Έχει αναφερθεί η μέτρηση και άλλων μορίων στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Σε μερικές από τις πλέον ενδιαφέρουσες μελέτες, προσδιορίστηκαν η προσταγλανδίνη E2 (PGE2) σε υγιή άτομα και ασθενείς με ΧΑΠ59, η ουρία σε υγιή άτομα και σε ασθενείς με άσθμα, ΧΑΠ και κυστική ίνωση60, πρωτεΐνες, νιτρικά/νιτρώδη, IL-1β και TNF-α σε καπνιστές και μη καπνιστές νεαρούς ενήλικες61, ενώ οι Gessner και συν. ανέφεραν την ανίχνευση DNA και τη δυνατότητα προσδιορισμού μεταλλάξεων του ογκογονιδίου K-ras σε ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα62. Πολλά από αυτά τα ευρήματα θα αποτελέσουν μελλοντικές ερευνητικές προοπτικές και παραμένει ανοικτό το ερώτημα τι ακριβώς μπορεί να ανιχνευθεί ακόμη στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα.

ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΜΕΤΡΗΣΕΩΝ ΣΤΟ ΣΥΜΠΥΚΝΩΜΑ ΤΟΥ ΕΚΠΝΕΟΜΕΝΟΥ ΑΕΡΑ ΣΕ ΠΑΘΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟΥ

Οι ερευνητικές κατευθύνσεις στις οποίες έχει στραφεί το ενδιαφέρον των ερευνητικών ομάδων που ασχολούνται με το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα περιλαμβάνουν παθήσεις στις οποίες η φλεγμονή των αεραγωγών παίζει κεντρικό ρόλο στον παθοφυσιολογικό μηχανισμό τους. Όπως τονίστηκε το 1999 στη συνάντηση της ομάδας του συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα στη Βουδαπέστη, στην οποία συμμετείχαμε ως προσκεκλημένη Κλινική, φαίνεται ότι οι μελλοντικές εφαρμογές της μεθόδου ίσως αποτελέσουν μια εναλλακτική λύση αντί του BAL. Στον πίνακα 1 αναφέρονται οι τιμές των κυριότερων μετρήσεων στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα και σε διάφορες παθήσεις.



Α. Βρογχικό άσθμα

Οι τιμές του H2O2 στους ασθματικούς ασθενείς είναι μεγαλύτερες από εκείνες των φυσιολογικών μαρτύρων σε όλες τις μελέτες, τόσο στους ενηλίκες (0,26± 0,29)11, όσο και στα παιδιά (μέση τιμή 0,60 μΜ)10. Σε μελέτη των Horvath και συν.44 διατυπώθηκε η άποψη ότι τα επίπεδα του H2O2 μπορούν να συσχετιστούν με τη βρογχική υπεραντιδραστικότητα των ασθματικών ασθενών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν συμπληρωματικά με το εκπνεόμενο NO για την παρακολούθηση της φλεγμονής των αεραγωγών. Οι τιμές του H2O2 ήταν 0,72±0,06 μΜ για τους ασθματικούς έναντι 0,43±0,08 για τους ασθματικούς που λάμβαναν στεροειδή και 0,27±0,04 για τους φυσιολογικούς εξετασθέντες. Σημαντικό εύρημα αυτής της μελέτης ήταν επίσης ότι το H2O2 αποτελεί περισσότερο ευαίσθητο δείκτη από το εκπνεόμενο NO για τον καθορισμό του οξειδωτικού stress, καθώς ασθενείς με σοβαρό ασταθές άσθμα εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα H2O2, παρά τη λήψη στεροειδών (εισπνεόμενων ή από το στόμα) σε υψηλές δόσεις, ενώ το NO ήταν φυσιολογικό. Τα επίπεδα του H2O2 δεν εμφάνιζαν συσχέτιση με τα σπιρομετρικά δεδομένα των ασθματικών ασθενών. Σε μια πρόσφατη μελέτη, εξάλλου, αναφέρεται μείωση των επιπέδων του H2O2 σε ασθματικούς ασθενείς μετά από χορήγηση εισπνεόμενων στεροειδών12. Το πρόβλημα, όμως, που παραμένει είναι να καθοριστεί ποιά είναι τα κύτταρα που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή του H2O2 στο άσθμα και κατά πόσο αυτά διαφέρουν σε σχέση με τη βαρύτητα της νόσου και τη λήψη εισπνεόμενων στεροειδών. Το ερώτημα αυτό προσπαθήσαμε να απαντήσουμε σε μια πρόσφατη μελέτη μας που τα πρόδρομα αποτελέσματά της ανακοινώθηκαν στο τελευταίο Συνέδριο της Αμερικανικής Θωρακικής Εταιρείας, ενώ το σύνολο της μελέτης βρίσκεται υπό κρίση σε ξένο περιοδικό. Σε αυτή δείξαμε ότι η παραγωγή του H2O2 οφείλεται κυρίως στα ηωσινόφιλα, ενώ στις βαρύτερες μορφές φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο η παρουσία των πολυμορφοπυ πολυμορφοπυρήνων. Συγχρόνως, δείξαμε ότι η βαρύτητα της νόσου καθώς και η λήψη των εισπνεόμενων στεροειδών αποτελούν βασικούς παράγοντες για την αξιολόγηση της οξειδωτικής φλεγμονής σε ασθενείς με άσθμα63.

Τα ισοπροστάνια αποτελούν έναν ακόμη δείκτη της οξειδωτικής φλεγμονής σε ασθενείς με βρογχικό άσθμα, που παρουσιάζει διαρκώς αυξανόμενο ενδιαφέρον. Τα επίπεδα του 8-isoprostane βρέθηκαν αυξημένα στους ασθενείς με βρογχικό άσθμα35. Συγκεκριμένα, οι ασθενείς με ήπιο και μέτριο άσθμα εμφάνιζαν διπλάσιες τιμές σε σχέση με τους φυσιολογικούς, ενώ οι τιμές εκείνων με σοβαρό άσθμα ήταν τριπλάσιες. Οι τιμές του 8-isoprostane εμφάνιζαν συσχέτιση με τις τιμές του εκπνεόμενου NO στους ασθενείς με ήπιο άσθμα, κάτι που δεν συνέβαινε σε εκείνους με μέτριο και σοβαρό άσθμα. Επιπρόσθετα, οι ασθενείς με ήπιο και μέτριο άσθμα εμφάνιζαν παραπλήσιες τιμές 8-isoprostane, γεγονός που αντανακλά σε ένα βαθμό τον έλεγχο της οξειδωτικής φλεγμονής με τα εισπνεόμενα στεροειδή στις ομάδες αυτές. Αντίθετα, οι ασθενείς με σοβαρό άσθμα εμφανίζουν σημαντικά μεγαλύτερες τιμές, κάτι που αντανακλά την αυξημένη οξειδωτική φλεγμονή αυτών των ασθενών30 και τον πλημμελή έλεγχο της νόσου με τα εισπνεόμενα στεροειδή.

Οι Hunt και συν.64 ανέφεραν αυξημένα επίπεδα νιτρωδών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθματικών ασθενών, κάτι που δεν διαπιστώθηκε από τους Nightingale και συν., που προσδιόρισαν νιτρώδη στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα φυσιολογικών ατόμων και ασθματικών ασθενών πριν και μετά από έκθεση σε όζον, με47 ή χωρίς48 χορήγηση εισπνεόμενων στεροειδών. Στις μελέτες αυτές δεν διαπιστώθηκε διαφορά στα επίπεδα των νιτρωδών μεταξύ ασθματικών και φυσιολογικών ατόμων, ενώ τα επίπεδα του NO ήταν αυξημένα στους ασθματικούς και οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι το εκπνεόμενο NO αποτελεί περισσότερο ευαίσθητο δείκτη για τη διάγνωση του άσθματος από τα νιτρώδη. Μετά την έκθεση σε όζον, δεν παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων των νιτρωδών ή του NO, παρά την προκαλούμενη πολυμορφοπυρηνική φλεγμονώδη απάντηση47. Ανάλογα ήταν και τα αποτελέσματα μετά τη χορήγηση βουδεσονίδης48. Σε δική μας μελέτη50, ωστόσο, μετρήσαμε το συνολικό ποσό νιτρικών/νιτρωδών το οποίο βρήκαμε αυξημένο στους ασθματικούς ασθενείς σε σχέση με τους φυσιολογικούς. Από τους ασθματικούς, εκείνοι που λάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή εμφάνιζαν χαμηλότερα επίπεδα νιτρικών/νιτρωδών (παραπλήσια με εκείνα των φυσιολογικών ατόμων) από εκείνους που δεν λάμβαναν στεροειδή. Επιπλέον, διαπιστώσαμε μια ισχυρά θετική συσχέτιση μεταξύ νιτρικών/νιτρωδών και H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Πιστεύουμε ότι για να μπορέσει κάποιος να αξιολογήσει την παρουσία των μεταβολιτών του NO στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα πρέπει να προσδιορίζει τα ολικά νιτρικά/νιτρώδη.

Πρόσφατα, προσδιορίστηκε νιτροτυροσίνη στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθματικών ασθενών54. Τα επίπεδα της νιτροτυροσίνης ήταν αυξημένα στους ασθενείς με ήπιο άσθμα που δεν λάμβαναν στεροειδή, ενώ ήταν χαμηλότερα σε εκείνους με σοβαρό άσθμα που λάμβαναν συστηματικά στεροειδή, γεγονός που αντανακλά πιθανώς τον περιορισμό του οξειδωτικού stress στους τελευταίους. Οι συγγραφείς θεωρούν ότι η νιτροτυροσίνη του εκπνεόμενου αέρα αποτελεί έναν περισσότερο ευαίσθητο δείκτη για την εκτίμηση του οξειδωτικού stress στο άσθμα. Στην ίδια μελέτη προσδιορίστηκαν λευκοτριένια (LTB4, LTC4, LTD4, LTE4) στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα και βρέθηκαν αυξημένα στους ασθενείς με μέτριο και σοβαρό άσθμα σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα και τους ασθενείς με ήπιο άσθμα.

Το pH του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχικό άσθμα στην οξεία φάση παρόξυνσης είναι σημαντικά χαμηλότερο από εκείνο των φυσιολογικών ατόμων (5,23±0,21 έναντι 7,65±0,20)55. Αντίθετα, στο σταθερό άσθμα, οι τιμές είναι παραπλήσιες με εκείνες των φυσιολογικών ατόμων (7,8±0,1), εύρημα που παρατηρείται και σε ασθενείς με παρόξυνση άσθματος που έλαβαν στεροειδή για περισσότερο από 48 ώρες (7,4±0,23). Οι ασθενείς που λάμβαναν θεραπεία με κορτικοειδή εμφάνισαν σταθερή αύξηση του pH μέχρι επαναφοράς στα φυσιολογικά επίπεδα. Φαίνεται ότι το pH των αεραγωγών αποτελεί σημαντική παράμετρο για τον καθορισμό της φλεγμονής των αεραγωγών και παίζει πιθανώς σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία του άσθματος. Άλλωστε είναι η πρώτη μέτρηση στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα στην οποία ο χρόνος που απαιτείται για την ολοκλήρωση της μέτρησης είναι σημαντικά μικρότερος από εκείνον που απαιτείται για όλες τις υπόλοιπες.

Τέλος, οι Antczak και συν.11 προσδιόρισαν τα επίπεδα των TBARs στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθματικών ασθενών και τα βρήκαν σημαντικά αυξημένα (0,073±0,071 nΜ) σε σχέση με εκείνα των φυσιολογικών ατόμων (0,004±0,009 nM).

Β. Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ)


Στους ασθενείς με ΧΑΠ, οι τιμές του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ποικίλλουν σημαντικά. Οι Dekhuizen και συν.13 προσδιόρισαν το H2O2 με τη μέθοδο της TMB και ανέφεραν ότι οι ασθενείς με ασταθή ΧΑΠ είχαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα H2O2 σε σχέση με εκείνων με σταθερή ΧΑΠ (0,6±0,075 έναντι 0,205±0,054 μΜ). Τα ευρήματα αυτά αποδόθηκαν από τους συγγραφείς στην αυξημένη παραγωγή οξειδωτικών ουσιών στους ασθενείς με ασταθή ΧΑΠ. Οι Nowak και συν.18 που χρησιμοποίησαν τη μέθοδο του HVA δεν διαπίστωσαν διαφορές μεταξύ των επιπέδων του H2O2 σε καπνιστές και μη καπνιστές ασθενείς με σταθερή ΧΑΠ (0,55±0,69 και 0,49±0,7 αντίστοιχα). Σε άλλη μελέτη των ίδιων συγγραφέων14, και οι δύο αυτές κατηγορίες ασθενών εμφάνιζαν αυξημένα επίπεδα H2O2 (0,41±0,54 και 0,44±0,65 αντίστοιχα) σε σχέση με τους υγιείς μη καπνιστές μάρτυρες (0,05±0,07 μΜ). Στην ίδια μελέτη, τα επίπεδα των TBARs στους ασθενείς με ΧΑΠ ήταν κατά πολύ μεγαλύτερα από εκείνα των φυσιολογικών ατόμων (0,48±0,86 μΜ έναντι 0,04±0,14 μΜ αντίστοιχα), εύρημα ενδεικτικό της αυξημένης υπεροξείδωσης των λιπών στους αεραγωγούς ασθενών με σταθερή ΧΑΠ.

Το 8-isoprostane μετρήθηκε στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με ΧΑΠ36. Δεν διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά στις τιμές του 8-isoprostane μεταξύ πρώην καπνιστών και καπνιστών με ΧΑΠ (39,9±3,1 pg/ml και 45,3±3,6 pg/ml αντίστοιχα), αλλά και οι δύο αυτές κατηγορίες είχαν σημαντικά αυξημένες τιμές σε σχέση με τους υγιείς καπνιστές (24,3±2,6 pg/ml) και τους υγιείς μη καπνιστές (10,8±0,8 pg/ml). Το εύρημα αυτό είναι ενδεικτικό της παρουσίας αυξημένου οξειδωτικού stress στους ασθενείς με σταθερή ΧΑΠ. Δεν έχει διευκρινιστεί, ωστόσο, ο ρόλος της θεραπείας με στεροειδή στα επίπεδα του 8-isoprostane στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα.

Γ. Κυστική Ίνωση


Τα επίπεδα του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με κυστική ίνωση ήταν χαμηλότερα εκείνων των υγιών ατόμων (0,064 έναντι 0,089 μΜ αντίστοιχα)16, γεγονός που το καθιστά ακατάλληλο δείκτη για την εκτίμηση της φλεγμονής των αεραγωγών. Το εύρημα αυτό μπορεί να οφείλεται στην αδυναμία ανίχνευσής του λόγω των πυωδών εκκρίσεων, στην αντίδραση με άλλα δραστικά μόρια ή στην αυξημένη αντιοξειδωτική δραστηριότητα που προκαλείται από την παγίδευση αντιοξειδωτικών ουσιών στις εκκρίσεις των αεραγωγών. Κατά ανάλογο τρόπο και το NO δεν αποτελεί αξιόπιστο δείκτη58 της φλεγμονής των αεραγωγών στην κυστική ίνωση. Οι Ho και συν.43 αναφέρουν χαρακτηριστικά ότι το εκπνεόμενο NO δεν είναι αυξημένο στην κυστική ίνωση και τις βρογχεκτασίες, παρά το φλεγμονώδη χαρακτήρα αυτών των παθήσεων. Πιθανές ερμηνείες αυτού του φαινομένου είναι η κακή διάχυση του NO διαμέσου των παχύρρευστων πυωδών εκκρίσεων στους αεραγωγούς, η απομάκρυνση του NO λόγω της αντίδρασής του με ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και η μειωμένη δραστηριότητα της iNOS (inducible NO synthase). Σε συμφωνία με τα προηγούμενα έρχεται και πρόσφατη μελέτη, στην οποία τα αυξημένα επίπεδα H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα παιδιών με κυστική ίνωση στην παρόξυνση της νόσου τους από το αναπνευστικό μειώθηκαν μετά από ενδοφλέβια χορήγηση αντιβιοτικών65.

Μια απάντηση στο προηγούμενο πρόβλημα της εκτίμησης της φλεγμονής των αεραγωγών στην κυστική ίνωση μπορεί να προέλθει από τον προσδιορισμό του 8-isoprostane και των προϊόντων του μεταβολισμού του NO (νιτρικά/νιτρώδη) στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα του 8-isoprostane στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με κυστική ίνωση ήταν περίπου 2,8 φορές υψηλότερα από εκείνα των φυσιολογικών ατόμων (42,7 (4,5) pg/ml έναντι 15,2 (1,7) pg/ml αντίστοιχα)38. Τα επίπεδα του 8-isoprostane εμφανίζουν σημαντική συσχέτιση με εκείνα του εκπνεόμενου μονοξειδίου του άνθρακα (CO) και είναι ενδεικτικά της παρουσίας αυξημένου οξειδωτικού stress λόγω υπεροξείδωσης λιπών στους αεραγωγούς ασθενών με κυστική ίνωση. Σε συμφωνία με τα προηγούμενα έρχονται και ανάλογα ευρήματα, που έδειξαν ότι τα επίπεδα των νιτρωδών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με κυστική ίνωση είναι αυξημένα (μέση τιμή 2,15 μΜ) σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα (μέση τιμή 0,36 μΜ)45, κάτι που δεν ισχύει όπως προαναφέρθηκε για το εκπνεόμενο NO. Ωστόσο, τα επίπεδα των νιτρωδών δεν διέφεραν σημαντικά στη μελέτη αυτή μεταξύ των ατόμων που λάμβαναν ή όχι εισπνεόμενα στεροειδή. Σε ανάλογα συμπεράσματα κατέληξαν και οι Cunningham και συν.58 που μέτρησαν νιτρώδη και ιντερλευκίνη-8 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα παιδιών με κυστική ίνωση. Τα επίπεδα νιτρωδών στα παιδιά με κυστική ίνωση ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνα των φυσιολογικών παιδιών (3,0 μΜ έναντι 0,5 μΜ αντίστοιχα). Σύμφωνα με τα προηγούμενα, το 8-isoprostane και τα νιτρώδη του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα αποτελούν περισσότερο αξιόπιστους δείκτες για την εκτίμηση της φλεγμονής των αεραγωγών από το εκπνεόμενο NO στην κυστική ίνωση.

Δ. Βρογχεκτασίες


Η μελέτη του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχεκτασίες έδειξε ότι είναι αυξημένο σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα (0,87±0,01 μΜ έναντι 0,26±0,04μΜ αντίστοιχα)15, χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ εκείνων που λάμβαναν ή όχι εισπνεόμενα στεροειδή. Τα επίπεδα του H2O2 στη μελέτη αυτή εμφάνιζαν αντίστροφη συσχέτιση με τη σοβαρότητα της νόσου που εκτιμήθηκε με βάση λειτουργικά δεδομένα, γεγονός που αντανακλά πιθανώς την αυξημένη οξειδωτική φλεγμονή των αεραγωγών στους ασθενείς με βρογχεκτασίες.

Σε πρόσφατη μελέτη φάνηκε ότι τα επίπεδα του H2O2 σε ασθενείς με βρογχεκτασίες σε σταθερή κατάσταση επηρεάζονται σημαντικά από το χρόνιο αποικισμό με Pseudomonas aeruginosa. Παράλληλα, εμφανίζουν σημαντική συσχέτιση με την παρουσία πολυμορφοπυρηνικής κυτταρικής φλεγμονής, την έκταση των βλαβών στον απεικονιστικό έλεγχο με HRCT και την κλινική βαρύτητα της νόσου7.

Ε. ARDS

Η οξειδωτική φλεγμονή παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του συνδρόμου οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS). Πολλές από τις αρχικές μελέτες πάνω στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα έγιναν σε Μονάδες Εντατικής Θεραπείας και σε ασθενείς που υποβάλλονταν σε μηχανική υποστήριξη της αναπνοής. Βρέθηκε ότι τα επίπεδα του H2O2 ήταν αυξημένα στους ασθενείς με ARDS σε σχέση με εκείνα των μαρτύρων (1,68±0,35 μΜ έναντι 0,34±0,08 αντίστοιχα)2. Σε ανάλογη μελέτη διαπιστώθηκαν αυξημένα επίπεδα του H2O2 στους ασθενείς με ARDS σε σχέση με εκείνα των ασθενών υπό μηχανική υποστήριξη της αναπνοής χωρίς πνευμονικές διηθήσεις (2,34±1,15 μΜ έναντι 0,99±0,72 μΜ)8. Στη μελέτη των Kietzmann και συν.6, όπου χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος με τη luminol, τα επίπεδα του H2O2 που ανιχνεύτηκαν ήταν 0,552 μΜ (εύρος τιμών 0,154-0,893 μΜ), ενώ οι μάρτυρες είχαν επίπεδα 0,095 μΜ (0,076-0,144). Στις μελέτες αυτές φαίνεται ότι υπάρχει ενεργός ρόλος του H2O2 στην πρόκληση πνευμονικής βλάβης, αν και δεν έχει διευκρινιστεί κατά πόσο η δημιουργία του H2O2 είναι το πρωτοπαθές συμβάν στην οξειδωτική διαδικασία ή αποτελεί συνοδό εύρημα.

Εκτός από τον προσδιορισμό του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με ARDS, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα του 8-isoprostane με τη μέθοδο GC-MS37. Οι συγγραφείς ανακοίνωσαν οκταπλάσια περίπου επίπεδα στους ασθενείς αυτούς σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα (86,9±27,6 pg/ml έναντι 6,7±3,8 pg/ml αντίστοιχα), γεγονός ενδεικτικό της παρουσίας σημαντικής οξειδωτικής φλεγμονής στο ARDS. Είναι πιθανό ότι το συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα που συλλέγεται στις μελέτες αυτές, λόγω της φύσεως των ασθενών, περιέχει πρόσμιξη σιέλου, γεγονός που αποτελεί σημαντικό μειονέκτημα για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων.

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ


Μελετώντας τα αποτελέσματα των μετρήσεων των διάφορων δεικτών φλεγμονής στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα μπορεί εύκολα να καταλήξει σε κάποια μεθοδολογικά προβλήματα. Η μέτρηση του H2O2 παρουσιάζει σημαντική μεταβλητότητα, τόσο ανάλογα με τη μέθοδο που χρησιμοποιείται όσο και στο πλαίσιό της κάθε νοσολογικής οντότητας. Παρ' όλα αυτά, το γεγονός ότι τα επίπεδά του είναι σημαντικά αυξημένα στους ασθενείς με φλεγμονώδεις παθήσεις των αεραγωγών που προαναφέρθηκαν, το καθιστά αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού stress. Παράλληλα, η μελέτη νεότερων δεικτών, όπως είναι το 8-isoprostane και τα προϊόντα μεταβολισμού του NO, άνοιξε νέους ορίζοντες στη μελέτη της οξειδωτικής φλεγμονής των αεραγωγών. Και οι δείκτες αυτοί εμφανίζουν μεθοδολογικά προβλήματα, κυρίως στα επίπεδα της τυποποίησής τους στις διάφορες μελέτες και της διευκρίνισης του ακριβούς ρόλου αυτών των μορίων στους παθογενετικούς μηχανισμούς της φλεγμονής των αεραγωγών. Πρωταρχική σημασία έχει, κατά συνέπεια, να διευκρινιστούν αρκετά προβλήματα σχετικά με τη συλλογή, την αποθήκευση και την ανάλυση του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα, προκειμένου να τυποποιηθεί η μελέτη του και να καταστεί εφικτή η σύγκριση των αποτελεσμάτων που προέρχονται από διαφορετικές ερευνητικές ομάδες. Οι αναφορές, τέλος, ανίχνευσης μεγαλύτερων μορίων στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα αποτελούν σημαντική προοπτική για μελλοντικές εφαρμογές. Παρά τα μεθοδολογικά προβλήματα που παρουσιάζει ακόμη η μέθοδος, ο μη επεμβατικός της χαρακτήρας που δίνει τη δυνατότητα επαναλαμβανόμενων μετρήσεων στο ίδιο άτομο και οι πολύτιμες πληροφορίες που έχουν συγκεντρωθεί με την εφαρμογή της την καθιστούν χρήσιμο μέσο για τη μελέτη της φλεγμονής των αεραγωγών.

Εκείνο, ωστόσο, που δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως σε καμιά από τις προηγούμενες μελέτες είναι η σχέση οξειδωτικού stress και φλεγμονής των αεραγωγών. Η μεγαλύτερη πρόκληση για το μέλλον είναι η πραγματοποίηση μελετών με αντικειμενικό στόχο τη διευκρίνιση αυτής της σχέσης. Εάν πράγματι το οξειδωτικό stress σχετίζεται με τη φλεγμονή των αεραγωγών σε κάποια νοσολογική οντότητα, η χορήγηση αντιοξειδωτικών ουσιών θα αποτελέσει μέσο ελέγχου της φλεγμονής και του παθογενετικο

© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE