Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Τα επίπεδα των νιτρικών/νιτρωδών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχικό άσθμα
ΠΕΡΙΛΗΨΗ. Η παραγωγή του μονοξειδίου του αζώτου (NO) αυξάνεται σε φλεγμονώδεις παθήσεις των αεραγωγών συμπεριλαμβανομένου και του βρογχικού άσθματος. Τα τελικά παράγωγα του βιολογικού μεταβολισμού του NO είναι τα νιτρικά (NO3) και τα νιτρώδη (NO2). Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) είναι αυξημένο στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχικό άσθμα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης οξειδωτικού στρες. Η συγκέντρωση των νιτρικών/νιτρωδών (NO3/NO2) καθώς και τα επίπεδα του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2O2) μετρήθηκαν στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα πενήντα ασθενών με βρογχικό άσθμα οι οποίοι βρίσκονταν σε σταθερή κλινική πορεία (όλοι άρρενες, όλοι ατοπικοί, με μέσο όρο ηλικίας: 22±3 χρόνια (SD), FEV1: 91±10% αναμ. PD20 0,262±0,16 mg, 20 υπό εισπνεόμενα στεροειδή, 30 χωρίς στεροειδή από τους οποίους οι 20 καπνιστές) καθώς και σε 10 φυσιολογικούς μη ατοπικούς (όλοι άρρενες με μέσο όρο ηλικίας: 23±4 χρόνια (SD), FEV1: 101±14% αναμ., PD20: 1,3±0,55 mg). Τα επίπεδα των νιτρικών/νιτρωδών (ΝO3/ΝO2) στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχικό άσθμα βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα συγκριτικά με τους φυσιολογικούς (1,08, 95% Cl 0,86-1,3 μΜ έναντι 0,6, 95% Cl 0,46-0,8 μΜ, p<0,001). Οι ασθενείς οι οποίοι ήταν σε αγωγή με εισπνεόμενα στεροειδή είχαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές συγκριτικά με αυτούς οι οποίοι δεν ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή (0,71, 95% Cl 0,55-0,87 μΜ έναντι 1,33, 95% Cl 1-1,65 μΜ, p<0,001). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και μεταξύ καπνιστών και μη καπνιστών (1,11, 95% Cl 0,74-1,47 μΜ έναντι 1,77 95% Cl 1,1-2,4 μΜ, p<0,0001). Βρέθηκε επίσης μια στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των νιτρικών/νιτρωδών και της συγκεντρώσεως του υπεροξειδίου του υδρογόνου στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα (r=0,48, p<0,0001). Αντίθετα, καμιά συσχέτιση δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των επιπέδων των νιτρικών/νιτρωδών, της απόφραξης των αεραγωγών, όπως αυτή εκφράζεται με την FEV1% αναμ. και της βρογχικής υπεραντιδραστικότητας, όπως αυτή εκφράζεται με την PD20 ως προς την ισταμίνη. Συμπερασματικά, τα επίπεδα των νιτρικών/νιτρωδών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα, είναι αυξημένα στους ασθενείς με βρογχικό άσθμα και φαίνεται να συσχετίζονται θετικά με το οξειδωτικό στρες, όπως αυτό καθορίζεται από τη συγκέντρωση του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η ταυτόχρονη μέτρηση των επιπέδων των NO2/NO3 και του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα έχει κλινική σημασία για την αξιολόγηση της φλεγμονής των αεραγωγών σε ασθενείς με βρογχικό άσθμα. Πνεύμων 2001, 14 (3): 224-231.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Το βρογχικό άσθμα είναι μια χρόνια νόσος του αναπνευστικού, με κύρια χαρακτηριστικά την αναστρεψιμότητα της αποφράξεως των αεραγωγών, τη φλεγμονή του βρογχικού επιθηλίου και τη βρογχική υπεραντιδραστικότητα. Έχει παρατηρηθεί ότι τα επίπεδα του μονοξειδίου του αζώτου (NO) είναι αυξημένα στον εκπνεόμενο αέρα ασθενών με βρογχικό άσθμα, ενώ είναι σημαντικά χαμηλότερα σε ασθενείς οι οποίοι βρίσκονται υπό αγωγή με εισπνεόμενα στεροειδή1. Έχει επίσης βρεθεί ότι η αυξημένη παραγωγή NO, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις επιτείνει την προκαλούμενη με οξειδωτικούς μηχανισμούς φλεγμονή των αεραγωγών2 μπορεί να έχει συγχρόνως και προστατευτικές ιδιότητες απέναντι στην κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από τη φλεγμονή αυτή3. Σε ένα υγρό περιβάλλον όπως είναι η εσωτερική επιφάνεια των αεραγωγών, η παραγωγή του NO μπορεί να εκφράζεται με το σχηματισμό σταθερών τελικών παραγώγων του μεταβολισμού του, όπως είναι τα νιτρικά (ΝΟ3) και νιτρώδη (ΝO2)4.

Το οξειδωτικό στρες, το οποίο ορίζεται ως αυξημένη έκθεση σε οξειδωτικούς παράγοντες και/ή μειωμένη αντιοξειδωτική δραστηριότητα, εμπλέκεται στις φλεγμονώδεις παθήσεις των αεραγωγών συμπεριλαμβανομένου και του άσθματος5. Τα κύτταρα τα οποία συμμετέχουν στη διαδικασία της φλεγμονής και ειδικά τα ηωσινόφιλα, έχει βρεθεί ότι απελευθερώνουν αρκετά παράγωγα οξυγόνου και αζώτου6. Ο συνδυασμός O2 και NO οδηγεί στο σχηματισμό υπεροξειδίου του αζώτου (ΟΝΟΟ-) το οποίο είναι ένα ιδιαίτερα δραστικό μόριο και μπορεί να προκαλέσει βλάβη στο βρογχικό επιθήλιο. Το O2 μεταβολίζεται ταχέως προς το σχηματισμό υπεροξειδίου του υδρογόνου (N2O2) το οποίο διαχέεται στους αεραγωγούς και εξατμίζεται στον εκπνεόμενο αέρα. Το Η2O2 είναι αυξημένο στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα σε ασθενείς με βρογχικό άσθμα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μη επεμβατικός δείκτης της φλεγμονής των αεραγωγών.

Βασισμένοι σε προηγούμενες έρευνες όπου τα τελικά παράγωγα του NO αντανακλούν την παραγωγή του7 στον εκπνεόμενο αέρα και χρησιμοποιώντας μια μη επεμβατική μέθοδο, όπως είναι το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα, ερευνήσαμε το κατά πόσο η ολική συγκέντρωση των νιτρικών/νιτρωδών αυξάνεται σε κλινικά σταθερούς ασθενείς με βρογχικό άσθμα και εάν αυτή η αύξηση σχετίζεται με την απόφραξη των αεραγωγών όπως αυτή εκφράζεται με την FEV1% αναμ. και με τη βρογχική υπεραντιδραστικότητα όπως αυτή εκφράζεται με την PDaa ως προς την ισταμίνη. Επιπλέον προσπαθήσαμε να δείξουμε εάν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης των νιτρικών/νιτρωδών και του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Για να διαπιστώσουμε τυχόν επίδραση των εισπνεόμενων στεροειδών όπως επίσης και του καπνίσματος, διενεργήθηκε περαιτέρω ανάλυση, κατανέμοντας τους συμμετέχοντες στις ανάλογες ομάδες.

ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ

Στη μελέτη συμμετείχαν πενήντα ασθενείς με βρογχικό άσθμα (20 υπό αγωγή με εισπνεόμενα στεροειδή (ΕΣ+), 30 χωρίς στεροειδή (ΕΣ–), εκ των οποίων 20 καπνιστές) και δέκα υγιείς μη ατοπικοί, μη καπνιστές (Πίνακας 1). Όλοι οι ασθματικοί είχαν θετικές δερματικές δοκιμασίες σε έξι κοινά αεροαλλεργιογόνα. Η διάγνωση του άσθματος τέθηκε με βάση τα κριτήρια της Αμερικανικής Θωρακικής Εταιρείας8. Οι ασθενείς οι οποίοι συμπεριελήφθησαν στην έρευνα ήταν όλοι σε σταθερή κλινική πορεία και δεν υπήρχαν ενδείξεις παροξύνσεως της νόσου για τουλάχιστον τέσσερις εβδομάδες πριν από τη συμμετοχή τους στη μελέτη. Κανένας δεν ελάμβανε εισπνεόμενα ή από του στόματος βλεννολυτικά ούτε οξυγονοθεραπεία. Είκοσι από τους ασθματικούς ελάμβαναν β2 διεγέρτες βραχείας δράσης ως ανακουφιστική αγωγή και δεκαπέντε ελάμβαναν β2 διεγέρτες μακράς δράσης. Οι φυσιολογικοί που συμμετείχαν είχαν αρνητικό ιστορικό αλλεργίας (αρνητικές δερματικές δοκιμασίες στα κοινά αλλεργιογόνα), φυσιολογική σπιρομέτρηση και δεν διαπιστώθηκε βρογχική υπεραντιδραστικότητα κατά τη δοκιμασία πρόκλησης με ισταμίνη στην οποία υποβλήθηκαν (PD20>0,800 mg, 1,3±0,55mg) (Πίνακας 1). Η ερευνητική μελέτη εγκρίθηκε από την Επιστημονική Επιτροπή του νοσοκομείου μας και όλοι οι συμμετέχοντες ενημερώθηκαν πριν τη συμμετοχή τους.



ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΙΑ ΤΟ ΡΟΛΟ ΤΩΝ ΕΙΣΠΝΕΟΜΕΝΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΑΠΝΙΣΤΙΚΗΣ ΣΥΝΗΘΕΙΑΣ

Οι συμμετέχοντες διαιρέθηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με τη χρήση των εισπνεόμενων στεροειδών: σε αυτούς οι οποίοι ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή (n=20) και σε αυτούς οι οποίοι δεν ελάμβαναν (n=30). Παρόμοια διαίρεση έγινε και ανάλογα με την καπνιστική συνήθεια των συμμετεχόντων: είκοσι ασθενείς ήταν καπνιστές (εκ των οποίων κανένας δεν ελάμβανε στεροειδή), ενώ οι υπόλοιποι τριάντα δεν είχαν κανένα ιστορικό καπνιστικής συνήθειας.

ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

Ο βίαια εκπνεόμενος όγκος σε ένα δευτερόλεπτο (FEV1) μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ξηρό σπιρόμετρο (Vica-test, Mijnhardt, Holland). Πραγματοποιήθηκαν τρεις προσπάθειες και η καλύτερη από αυτές εκφράστηκε ως επί τοις εκατό της αναμενόμενης. Η βρογχική υπεραντιδραστικότητα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρόκλησης με ισταμίνη. Η PD20 υπολογίστηκε με τον υπολογισμό της ημιλογαριθμικής καμπύλης που περιγράφει τη σχέση δόσης-απάντησης.

Συλλογή συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα και μέτρηση ολικών νιτρικών/νιτρωδών και υπεροξειδίου του υδρογόνου

Η συλλογή του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα έγινε σε πρωϊνές ώρες χρησιμοποιώντας μια εναλλακτική μέθοδο ψύξεως των σωλήνων συλλογής. Το μηχάνημα που χρησιμοποιείται για την πρόκληση με ψυχρό αέρα λειτούργησε στη συγκεκριμένη μέθοδο ως μέσο παραγωγής ψυχρού αέρα σε θερμοκρασίες -15°C έως -18°C με ροή αέρα 80 λίτρα/λεπτό. Το ένα άκρο ενός διπλού γυάλινου σωλήνα μήκους 30 cm συνδέθηκε με το σημείο εξόδου του ψυχρού αέρα, ενώ στο άλλο άκρο γινόταν η εκπνοή των ατόμων της μελέτης. Ο σωλήνας στο επάνω μέρος είχε μια βαλβίδα 2 κατευθύνσεων (Heins Rudolf), με σκοπό να διακρίνεται η εισπνοή από την εκπνοή. Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη πριν ξεκινήσουν τη διαδικασία συλλογής του συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα έκαναν στοματοφαρρυγγικές πλύσεις με νερό, ενώ η διαδικασία συλλογής έγινε σε καθιστική θέση με σταθερή και ήρεμη αναπνοή και για χρονικό διάστημα 10 λεπτών. Το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα συλλέχθηκε στο άκρο που ήταν συνδεδεμένο με το μηχάνημα του ψυχρού αέρα και άμεσα διατηρήθηκε στους -70°C για τη μετέπειτα επεξεργασία. Με την παραπάνω μέθοδο συλλέγεται τουλάχιστον 1 ml συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα σε πλαστικό σωληνάριο χωρητικότητας 3 ml. H μέτρηση όλων των δειγμάτων του N2O2 και των ΝO3/ΝO2 έγινε την ίδια ημέρα και σε διάστημα 20 ημερών από τη στιγμή της συλλογής. Οι μετρήσεις έγιναν σε 4 ομάδες (μικρότερος χρόνος μέτρησης 2 ημέρες - μεγαλύτερος χρόνος μέτρησης 20 ημέρες από τη συλλογή). Όλα τα δείγματα ελέγχθηκαν για την παρουσία σιέλου με τη μέθοδο ανίχνευσης της αμυλάσης. Η ανίχνευση αμυλάσης έγινε με φασματοφωτομετρική μέθοδο, χρησιμοποιώντας ως αντιδραστήριο το ΚΟΝΕ Instr. Finland. Με αυτή τη μέθοδο, η α-αμυλάση του δείγματος και το ένζυμο α-γλυκοσιδάση υδρολύουν το υπόστρωμα π-νιτροφενυλο-α-δ μαλτοχεπταοσίδη σε γλυκόζη και π-νιτροφενόλη. Ακολουθεί η απελευθέρωση της π-νιτροφενόλης στα 405 nm (37°C) για 2 λεπτά. Σε δύο δείγματα έγινε έγχυση σιέλου, με σκοπό να ελεγχθεί η ευαισθησία της μεθόδου. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφηκε δεν ανευρέθηκε αμυλάση σε κανένα από τα δείγματα της μελέτης. Στα δείγματα που έγινε έγχυση σιέλου ανιχνεύθηκε αμυλάση >5000 IU. Η αναπαραγωγιμότητα των επιπέδων του Η2O2 και των ΝO3/ΝO2 ελέγχθηκε σε 2 διαφορετικές ημέρες σε 5 φυσιολογικούς και σε δέκα ασθενείς που επιλέχθηκαν τυχαία. Για τον έλεγχο σταθερότητας του δείγματος χρησιμοποιήθηκαν 8 άτομα (4 ασθενείς). Στα παραπάνω άτομα ελήφθησαν 4 ml δείγματος. Αυτή η ποσότητα χωρίσθηκε σε 4 ίσα μέρη και η μέτρηση του H2Ο2 και των NO3/NO2 έγινε σε χρονικό διάστημα 2 ημερών, 1 εβδομάδας, 2 εβδομάδων και 3 εβδομάδων, που αποτελεί και το μέγιστο χρόνο μέτρησης που χρησιμοποιήθηκε για όλα τα δείγματα. Η αναπαραγωγιμότητα των επιπέδων τόσο των NO3/NO2 όσο και του Η2O2 καθώς και η σταθερότητα των δειγμάτων εκτιμήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγούμενα στη βιβλιογραφία9.

Όσον αφορά στη μέτρηση των νιτρικών/νιτρωδών, προσδιορίσθηκε η συνολική ποσότητά τους στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Τα νιτρικά κατ' αρχήν μετατράπηκαν ενζυμικά σε νιτρώδη με την επίδραση της αναγωγάσης των νιτρικών10 και ακολούθως προσδιορίσθηκε η συνολική ποσότητα νιτρικών στο δείγμα (αναχθέντα νιτρικά+νιτρώδη) με την αντίδραση Griess11. Αναλυτικότερα: 60 μl συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα αναμίχθηκαν με 10 μl NADPH 0,5 mM και 10 μl μίγματος αναγωγάσης των νιτρικών (2000 U/Ι) και FAD 50 mol/l. Τα δείγματα επωάσθηκαν για 30 λεπτά στους 37°C και εν συνεχεία προστέθηκαν 10 μl LDH (100 mg/l) και 10 μl πυροσταφυλικού νατρίου (100 mmol/l). Ακολούθησε περαιτέρω επώαση επί 10 λεπτά στους 37°C ώστε να επιτευχθεί η οξείδωση της περίσσειας του NADPH. Στη συνέχεια, τα ανωτέρω 100 μl δείγματος αναμίχθηκαν με 100 μl αντιδραστηρίου Griess (1 g/f σουλφανιλαμίδη, 25 g/l Η3ΡO4 και 0,1 g/l N-1 ναφθυλ-εθυλενδιαμίνη). Μετά από παραμονή για 10 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, μετρήθηκε η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος στα 550 nm σε φωτόμετρο και προσδιορίσθηκαν οι συγκεντρώσεις έναντι πρότυπης καμπύλης. Οι προσδιορισθείσες συγκεντρώσεις εκφράζουν τη συνολική ποσότητα νιτρικών και νιτρωδών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Για τη μέτρηση του H2O2 χρησιμοποιήθηκε η παραπάνω περιγραφείσα ενζυμική μέθοδος12,13. Περιληπτικά 250 μl διαλύματος 420 μΜ 3',3,5,5' τετραμεθυλβενζιδίνης (διαλυμένης σε 0,42 Μ κιτρικού ρυθμιστικού διαλύματος, pH 3,8) και 10 μl διαλύματος 52,5 U/ml υπεροξειδάσης horseradish (HRP, Sigma Chemicals, St Louis, USA) αναμίχθηκαν με 250 μl δείγματος εκπνεόμενου αέρα για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το μείγμα αυτό οξειδώθηκε σε pH 1 με 10 μl διαλύματος θειϊκού οξέος 18 Ν. Το προϊόν της αντίδρασης προσδιορίσθηκε ποσοτικά με απορρόφηση σε 450 nm, χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο διπλής ακτίνας (Uvicon 940, Kontron Instr.). Μετρήθηκε τελικά με αυτόματο αναλυτή (model EL 312 Biotec). To κατώτερο όριο μέτρησης ήταν 0,1 μΜ H2O2.

Στατιστική ανάλυση

Οι τιμές των παραμέτρων της μελέτης που αφορούν τα χαρακτηριστικά των ασθενών και των φυσιολογικών ατόμων εκφράστηκαν ως μέση τιμή (SD) με το εύρος των τιμών σε παρένθεση. Οι τιμές που αφορούσαν στη σύγκριση μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων των μελετηθεισών ομάδων, εκφράστηκαν ως μέση τιμή με 95% διαστήματα αξιοπιστίας (confidence intervals-Cl). Οι παράμετροι των ασθενών και των φυσιολογικών ατόμων όπως επίσης και μεταξύ των υποομάδων συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το student-t-test. Για τη μελέτη της σχέσης μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης κατά Pearson. Η τιμή p <0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Η αξιολόγηση της επαναληψιμότητας των μετρήσεων των επιπέδων των NO2/NO3 για δύο συνεχόμενες ημέ ημέρες, έδειξε μια μέση τιμή διαφοράς μεταξύ των μετρήσεων της τάξεως του 0,07±0,04 μΜ για τους ασθενείς και 0,03±0,02 μΜ για τους φυσιολογικούς. Η σταθερότητα της συνολικής συγκέντρωσης των NO2/NO3 στα κατεψυγμένα δείγματα έδειξε ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των τεσσάρων μετρήσεων (0,62±0,41 μΜ σε δύο ημέρες, 0,64±0,4 μΜ σε μια εβδομάδα, 0,6±0,4 μΜ σε δύο εβδομάδες και 0,64 + 0,42 μΜ μετά από τρεις εβδομάδες (p=0,55). Η αξιολόγηση της επαναληψιμότητας των μετρήσεων των επιπέδων του Η2Ο2 για δύο συνεχόμενες ημέρες έδειξε μια μέση τιμή διαφοράς μεταξύ των μετρήσεων της τάξεως του 0,04± 0,02 μΜ για τους ασθενείς και 0,07 μΜ±0,03 μΜ για τους φυσιολογικούς. Η σταθερότητα του συνολικής συγκέντρωσης της Η2O2 στα κατεψυγμένα δείγματα έδειξε ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ των τεσσάρων μετρήσεων (0,55±0,21 μΜ σε δύο ημέρες, 0,58±0,33 μΜ σε μια εβδομάδα, 0,6±0,3 μΜ σε δύο εβδομάδες και 0,63±0,46 μΜ μετά από τρεις εβδομάδες (p=0,76).

Η μέση τιμή επιπέδων (95% Cl) των συνολικών NO2/NO3 ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένη στους ασθματικούς ασθενείς συγκριτικά με τους φυσιολογικούς (1,08, 0,86-1,33 μΜ έναντι 0,63, 0,20-0,41 μΜ αντίστοιχα, p<0,001, Εικόνα 1). Η μέση τιμή (95% Cl) της συγκέντρωσης του Η2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ήταν σημαντικά υψηλότερη στους ασθενείς με βρογχικό άσθμα συγκριτικά με τους φυσιολογικούς (0,6, 0,48-0,71 μΜ έναντι 0,3, 0,2-0,4 μΜ αντίστοιχα, p<0,005). Οι ασθενείς οι οποίοι βρίσκονταν υπό αγωγή με εισπνεόμενα στεροειδή, είχαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα NO2/NO3 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα - παρεμφερή με των φυσιολογικών - συγκρινόμενα με αυτά των ασθενών που δεν ελάμβαναν στεροειδή (0,71 95% Cl 0,55-0,87 μΜ έναντι 1,33 95% Cl 1-1,65 μΜ, p<0,001, εικόνα 1). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και μεταξύ καπνιστών και μη καπνιστών (1,11, 95% Cl 0,74-1,47 μΜ έναντι 1,77 95% Cl 1,1-2,4 μΜ, p<0,0001, εικόνα 1). Υπήρξε μια σημαντικά θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των ΝO2/ΝO3 και της συγκεντρώσεως του Η2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα (r=0,48, p<0,0001, Εικόνα 2). Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε κάποια συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των ΝO2/ΝO3 και είτε της PD20 ως προς την ισταμίνη, είτε της FEV1% αναμ. (r=0,04, p=0,77, r=0,1, p=0,3 αντίστοιχα).


ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η έρευνά μας έδειξε ότι τα επίπεδα των νιτρικών/νιτρωδών (ΝΟ3/ΝO2) στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ήταν αυξημένα στους ασθματικούς ασθενείς συγκριτικά με τους φυσιολογικούς και ήταν σημαντικά επηρεασμένα τόσο από τη χρήση των εισπνεόμενων στεροειδών όσο και από την καπνιστική συνήθεια. Δεν βρέθηκε να υπάρχει κάποια συσχέτισή τους ούτε με την απόφραξη των αεραγωγών ούτε και με τη βρογχική υπεραντιδραστικότητα, όπως αυτή εκφράστηκε με την PDzo ως προς την ισταμίνη. Βρήκαμε επίσης ότι τα τελικά παράγωγα του μεταβολισμού του NO είχαν σημαντική συσχέτιση με τη συγκέντρωση του H2O2. Το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα έχει χρησιμοποιηθεί πρόσφατα ως μέθοδος μέτρησης της φλεγμονής των αεραγωγών. Είναι μια μη επεμβατική μέθοδος, απλή στην εκτέλεσή της, με υψηλή επαναληψιμότητα και αντανακλά μεταβολές οι οποίες διαπιστώνονται σε υλικά που λαμβάνονται με τη βρογχοσκόπηση14,15, με την προκλητή απόχρεμψη7 καθώς και με τη μελέτη του εκπνεόμενου αέρα16. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε, αν και βασίζεται στη φιλοσοφία των προηγούμενων περιγραφεισών μεθόδων, έχει δύο βασικά πλεονεκτήματα. Πρώτον, αποφεύγεται η ανάμειξη με σίελο, δεδομένου ότι η συλλογή γίνεται στο άλλο άκρο του σωλήνα που βρίσκεται 30 cm μακρύτερα από το στόμα του ασθενούς. Δεύτερον, επιτυγχάνεται σταθερή θερμοκρασία ψύξεως του δείγματος μέσω του μηχανήματος του ψυχρού αέρα, κάτι που δεν συμβαίνει στις άλλες μεθόδους που χρησιμοποιούν πάγο για τη συμπύκνωση του εκπνεόμενου σέρα. Τα ευρήματά μας είναι συμβατά με προηγούμενες παρατηρήσεις όσον αφορά στα επίπεδα του εκπνεόμενου NO στους ασθματικούς1. Είναι γνωστό ότι το NO είναι ασταθές μόριο και ότι η ταχύτητα αντίδρασης προς το σχηματισμό NO3/NO2 είναι ταχεία και επηρεάζεται από τη φλεγμονή των αεραγωγών. Εφόσον τα NO3/NO2 δεν είναι πτητικά, η παρουσία τους στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα προέρχεται από μικρά σταγονίδια του υγρού της εσωτερικής επιφάνειας του βρογχικού επιθηλίου τα οποία δημιουργούνται μέσω της ταχύτητας της ροής του αέρα μέσα από τους βρόγχους και τα βρογχιόλια. Τα αυξημένα επίπεδα των παραγώγων του NO στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα είναι πιθανόν να οφείλονται στην επαγωγή των iNOS από κυτταροκίνες και άλλους μεσολαβητές της φλεγμονής οι οποίοι απελευθερώνονται στους αεραγωγούς των ασθματικών ασθενών. Το γεγονός αυτό, εν μέρει συμφωνεί και με τα δικά μας ευρήματα όπως επίσης και με προηγούμενες παρατηρήσεις όπου τα εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή εμποδίζουν την επαγωγή των iNOS από τις κυτταροκίνες των επιθηλιακών κυττάρων17. Η χαμηλή συγκέντρωση των παραγώγων του NO στους καπνιστές είναι παρόμοια με αυτή που στο παρελθόν έχει αναφερθεί για το εκπνεόμενο NO και είναι πιθανόν ότι οφείλεται στην ελάττωση της δραστηριότητας των iNOS που προκαλείται από την υψηλή συγκέντρωση του NO στον καπνό του τσιγάρου18.

Η κυτταρική προέλευση των νιτρικών/νιτρωδών στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα δεν είναι γνωστή. Είναι πιθανόν να προέρχονται από τη δραστηριότητα των iNOS στους αεραγωγούς. Ανοσοϊστοχημικές μελέτες προτείνουν ως πολύ πιθανή την προέλευσή τους από τα επιθηλιακά κύτταρα ενώ υπάρχουν και κάποιες ενδείξεις για δραστηριότητα των iNOS στα μακροφάγα των αεραγωγών. Ωστόσο, λόγω της προέλευσης του συμπυκνώματος του εκπνεόμενου αέρα, τα νιτρικά/νιτρώδη είναι πιθανόν να προέρχονται και από τα φλεγμονώδη κύτταρα τα οποία διηθούν τους αεραγωγούς. Αυτό φαίνεται να επιβεβαιώνεται εν μέρει από προηγούμενη μελέτη όπου πτύελα από προκλητή απόχρεμψη χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση της συγκέντρωσης των νιτρικών/νιτρωδών7.

Στη μελέτη μας δεν βρέθηκε να υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης των μεταβολιτών του NO και της απόφραξης των αεραγωγών όπως αυτή εκφράζεται με την FEV1% αναμ., αλλά αξίζει να σημειωθεί ότι οι περισσότεροι ασθενείς μας είχαν ήπιο άσθμα με φυσιολογικές τιμές ως προς την FEV1% αναμ. Η έλλειψη συσχέτισης μεταξύ των τελικών προϊόντων του μεταβολισμού του NO και της βρογχικής υπεραντιδραστικότητας είναι παρόμοια με αυτή που είχε αναφερθεί και στο παρελθόν μεταξύ της συγκέντρωσης των νιτρικών/νιτρωδών στην προκλητή απόχρεμψη και της βρογχικής υπεραντιδραστικότητας ως προς τη μεταχολίνη7. Αυτό ίσως οφείλεται στο ότι τα τελικά παράγωγα του εκπνεόμενου NO αντανακλούν μόνο την ενεργό φλεγμονή και τη βραχεία αντίδραση. Από την άλλη πλευρά όμως, η βρογχική υπεραντιδραστικότητα αντανακλά τόσο την ενεργό φλεγμονή όσο και τη χρονιότητα της βλάβης καθώς και την ανακατασκευή του ιστού κατά τη διαδικασία της επούλωσης (healing remodeling)19. Επιπλέον δεν υπάρχει συμφωνία στις περισσότερες έρευνες, όσον αφορά στο ρόλο του NO στην πρόβλεψη του βαθμού της βρογχικής υπεραντιδραστικότητας20,21. O ρόλος του NO στη φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες είναι πολύπλοκος και εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ NO και O2. Τα ευρήματά μας συμφωνούν με προηγούμενες παρατηρήσεις όπου η αυξημένη παραγωγή του ενδογενούς NO έχει κυτταροτοξική επίδραση στα κύτταρα και τον πνευμονικό ιστό μεταβάλλοντας τη διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης22,23 ή δίνοντας το έναυσμα στα πνευμονικά μακροφάγα24 να απελευθερώσουν αντιδραστικό άζωτο και παράγωγα του οξυγόνου τα οποία είναι ικανά να προκαλέσουν βλάβη των ιστών25 και καταστροφή του DNA26. Παρ' όλα αυτά, σε μια προηγούμενη μελέτη, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης του NO στον εκπνεόμενο αέρα και της συγκέντρωσης του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα27. Αυτό ενδεχομένως θα μπορούσε να ερμηνευθεί από τη θεωρία ότι είναι ακαθόριστο τι αναλογία από τη συνολική παραγωγή του NO αντανακλάται από το εκπνεόμενο σε αέρια μορφή NO28 και επιπλέον είναι πιο λογικό να συγκριθούν υλικά τα οποία λαμβάνονται με την ίδια μέθοδο. Περισσότερες μελέτες είναι αναγκαίες προς αυτή την κατεύθυνση, αφού το NO αντιδρά με το Η2O2 προς σχηματισμό υπεροξειδίου του αζώτου και στη συνέχεια νιτροτυροσίνης, με τη μέτρηση της τελευταίας να αποτελεί ενδεχομένως το συνδετικό κρίκο μεταξύ των δύο ουσιών.

Συνοψίζοντας, δείξαμε την παρουσία υψηλών επιπέδων παραγώγων του NO στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχικό άσθμα. Η μέτρηση των επιπέδων των NO2/NO3 και του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα ενδεχομένως να αποδειχθεί κλινικά χρήσιμη ως προς τη συνολική αξιολόγηση της φλεγμονής των αεραγωγών σε ασθενείς με βρογχικό άσθμα.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Kharitonov SA, Yates D, Robbins RA, Logan-Sinclair R, Shinebourne EA, Barnes PG. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Lancet 1994, 343:133-135.
2. Ichiropoulos H. Biological tyrosine nitration: a pathophysiological function of nitric oxide and reactive oxygen species. Arch Biochem Biophys 1998, 356:1-11.
3. Kroncke KD, Fehsei K, Kolb-Bachofen V. Nitric oxide: cytotoxicity versus cytoprotection-how, why, when, and where? Nitric Οxide Biol Chem 1997 1:107-120.
4. Gaston B, Drazen JM, Loscalzo J, Stamler JS. The biology of nitrogen oxides in the airways. Am J Respir Crit Care Med 1994, 149:538-551.
5. Dohlman AW, Black HR, Royal JA. Expired breath hydrogen peroxide is a marker of acute airway inflammation in paediatric patients with asthma. Am Rev Respir Dis 1993, 148:955-960.
6. Barnes PJ. Reactive oxygen species and airway inflammation. Free Rad Biol & Med 1990, 9:235-243.
7. Kanazawa H, Shoji S, Yamada M, et al. Increased levels of nitric oxide in induced sputum in patients with asthma. J Allergy Clin Immunol 1997, 99:624-629.
8. American Thoracic Society Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma. Am Rev Respir Dis 1987, 136:225-244. 9. Jobsis Q, Raatgeep HC, Schellekens SL, et al. Hydrogen peroxide in exhaled air of healthy children: reference values. Eur Respir J 1998, 12:483-485.
10. Moshage H, Kok B, Huizeng R, Jansen P. Nitrate and nitrite determination in plasma. A Critical Evaluation. Clin Chem 1995, 41:892-896.
11. Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannenbaum SR. Analysis of nitrate/nitrite and [N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem 1982, 126:131-138.
12. Dekhuijzen RPN, Aben KKH, Dekker I, Aarts LPHJ, Wielders PLML,Van Herwaarden CLA. Increased exhalation of hydrogen peroxide in patients with stable and unstable chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1996, 154:813-816.
13. Gallati H, Pracht l. Horseradish peroxidase: kinetic studies and optimization of peroxidase activity determination using the substrates N2O2 and 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine. J Clin Chem Clin Biochem 1985, 23:453-460.
14. Arias-Diaz J, Vara E, Torres-Melero J, et al. Nitrite/nitrate and cytokine levels in bronchoalveolar lavage fluid of lung cancer patients. Cancer 1994, 74:1546-1551.
15. Pheng LH, Francoeur C, Denis M. The involvement of nitric oxide in a mouse model of adult respiratory distress syndrome. Inflammation 1995, 19:599-610.
16. Kanazawa H, Shoji S, Yoshikawa T, Hirata K, Yoshikawa J. Increased production of endogenous nitric oxide in patients with bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Clin Exp Allergy 1998, 28:1244-1250.
17. Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled nitric oxide: a marker of airway inflammation? Current Opinion in Anaesthesiology 1996, 9:542-548.
18. Kharitonov SA, Alving K, Barnes PJ. Exhaled and nasal nitric oxide measurements: recommendations. Eur Respir J 1997, 10:1683-1693.
19. Henriksen AH, Lingaus-Holmen T, Sue-Chue M, Brener L. Combined use of exhaled nitric oxide and airway hyperresponsiveness in characterizing asthma in a large population survey. Eur Respir J 2000, 15:849-855.
20. Jatakanov A, Lin S, Kharitonov SA, Chung FK, Barnes PJ. Correlation between exhaled NO sputum EOS and bronchial responsiveness in patients with mild asthma. Thorax 1998, 53:91-95.
21. Gratziou CH, Lignos M, Dassiou M, Roussos CH. Influence of atopy on exhaled NO in patients with stable asthma and rhinitis. Eur Respir J 1999, 14:897-890.
22. Mercer RR, Costa DL, Crapo JD. Effects of prolonged exposure to low doses of nitric oxide or nitrogen dioxide on the alveolar septa of the adult rat lung. Lab Invest 1995, 73:20-28.
23. Freeman B. Free radical chemistry of nitric oxide. Looking at the dark side. Review Chest 1994, 105: Suppl. 79S-84S.
24. Hugod C. Ultrastructural changes of the rabbit lung after a 5 ppm nitric oxide exposure. Arch Environ Health 1979, 34:12-17.
25. Weinberger B, Fakhrzadeh L, Heck DE, Laskin JD, Gardiner CR, Laskin D. Inhaled nitric oxide primes lung macrophages to produce reactive oxygen and nitrogen intermediates. Am J Respir Crit Care Med 1998, 158:931-938.
26. Wiseman H, Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and reactive species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochem J 1996, 313:17-29.
27. Horvath I, Donnely LE, Kiss A, et al. Combined use of exhaled hydrogen peroxide and nitric oxide in monitoring asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998, 158:1042-1046.
28. Ho LP, Innes JA, Greening AP. Nitrite levels in breath condensate of patients with cystic fibrosis is elevated in contrast to exhaled nitric oxide. Thorax 1998, 53:680-684.

© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE