Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Επιδημιολογική διερεύνηση με μοριακές τεχνικές κλινικών στελεχών Mycobacterium tuberculosis
ΠΕΡΙΛΗΨΗ: Η ανίχνευση της πηγής μόλυνσης από Mycobacterium tuberculosis αποτελεί σημαντικό παράγοντα για τον έλεγχο μετάδοσης της φυματίωσης. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να συγκριθούν δύο διαφορετικές μοριακές μέθοδοι: Οι αναλύσεις RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) και RAPD (Randοm Amplified Length Polymorphic DNA) για την επιδημιολογική διερεύνηση κλινικών στελεχών Μ. tuberculosis. Υλικό αποτέλεσαν στελέχη Μ. tuberculosis απομονούμενα από το Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων σε διάστημα δύο χρόνων (1997-1998). Η ανάλυση RFLP, με τη χρησιμοποίηση του μη ραδιοσημασμένου ανιχνευτή (probe) IS6110, εφαρμόστηκε σε 25 μη σχετιζόμενα μεταξύ τους, ευαίσθητα στα διάφορα αντιφυματικά, κλινικά στελέχη Μ. tuberculosis, καθώς και σε στελέχη απομονούμενα από οικογένειες ασθενών. Με την ανάλυση RAPD μελετήθηκαν 17 ανθεκτικά στη ριφαμπικίνη και 43 ανθεκτικά στην ισονιαζίδη, άσχετα μεταξύ τους, στελέχη Μ. tuberculosis, καθώς και στελέχη από επιδημίες εντός οικογενειών. Για την RAPD χρησιμοποιήθηκε α) συνδυασμός τριών εκκινητών (primers): Α1245 με νουκλεοτιδική αλληλουχία 5’GCCGCCGAAACGATCTAC-3', B1245 (5'-AGGTGGCGTCGAGGAAGAC-3'), και Leg2 (5'-CTGGCTTCTTCCAGCTTCA-3') και β) ένας μόνο primer: IRIS (5’GAGTCTcrGGAC(Α+Τ)(C+Τ)(A+G)CCGGGGCGGTTCA-3'). Και οι δύο μέθοδοι τυποποίησαν με επιτυχία σχετιζόμενα και μη στελέχη Μ. tuberculosis. Σε σχέση με την RFLP, η RAPD ήταν πιο εύκολη και οικονομική στην εφαρμογή της, ειδικά με την χρησιμοποίηση του primer IRIS, που φάνηκε να έχει τη μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα. Πνεύμων 2000, 13 (2): 102-107
ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η φυματίωση παραμένει σοβαρό πρόβλημα της Δημόσιας Υγείας σε όλες τις αναπτυσσόμενες χώρες. Τα τελευταία όμως δέκα χρόνια, με την εμφάνιση του AIDS και την ευρεία μετακίνηση αλλοδαπών από περιοχές όπου ενδημεί η νόσος, η φυματίωση έχει καταστεί πρόβλημα και για τις αναπτυγμένες χώρες1. Η αύξηση αυτή συνοδεύεται από αύξηση της απομόνωσης στελεχών Μ. tuberculosis ανθεκτικών σε ένα ή περισσότερα αντιφυματικά φάρμακα2. Στις ΗΠΑ, 13% περίπου των νέων περιπτώσεων φυματίωσης είναι ανθεκτικές σε ένα τουλάχιστον πρωτεύον αντιφυματικό φάρμακο και 3.2% σε ισονιαζίδη/ριφαμπικίνη3.

Στην Ελλάδα, τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αύξηση της επίπτωσης της φυματίωσης, αποτέλεσμα κυρίως της αθρόας μετανάστευσης ατόμων από χώρες με πολύ υψηλή επίπτωση της νόσου όπως η πρώην Σοβιετική Ένωση και χώρες της Βαλκανικής, Ανατολικής Ευρώπης και Ασίας4. Πρόβλημα αποτελεί όχι μόνον η διάγνωση των πασχόντων μεταναστών, αλλά πολύ περισσότερο η παρακολούθησή τους για τη σωστή εφαρμογή της αντιφυματικής θεραπείας, προϋπόθεση απαραίτητη για τη μη εμφάνιση πολυανθεκτικών στελεχών. Γεγονός είναι ότι το ποσοστό αντοχής στη ριφαμπικίνη αυξήθηκε από 1.07% το 1996 σε 3,3% το 1998, ενώ το ποσοστό απομόνωσης πολυανθεκτικών στελεχών για το ίδιο διάστημα παρέμεινε σταθερό στο 1.8% (αδημοσίευτα αποτελέσματα του Εθνικού Κέντρου Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων).

Για την αντιμετώπιση του προβλήματος, πρωτεύοντα ρόλο παίζει η επιλογή των κατάλληλων εργαστηριακών μεθόδων, οι οποίες επιτρέπουν, όχι μόνο την όσο το δυνατόν ταχύτερη διάγνωση της νόσου, αλλά και την ανεύρεση της πηγής μόλυνσης. Η φυματίωση μεταδίδεται κυρίως από άτομο σε άτομο, άρα η εξέταση των ατόμων που ήρθαν σε επαφή με τον πάσχοντα, καθώς και η ανίχνευση της πηγής μόλυνσης, αποτελούν παράγοντες πολύ σημαντικούς στον έλεγχο διασποράς του μυκοβακτηριδίου. Προς την κατεύθυνση αυτή σημαντικό ρόλο παίζουν οι τεχνικές μοριακής βιολογίας, οι οποίες επιτρέπουν την ταχεία διάγνωση τυχόν ανθεκτικού στελέχους Μ. tuberculosis και την ιχνηλάτηση με ιδιαίτερη ακρίβεια της πηγής μόλυνσης5.

Οι μοριακές μέθοδοι δακτυλικών αποτυπωμάτων (fingerprinting), με τη χρησιμοποίηση της επαναλαμβανόμενης μέσα στο μυκοβακτηριδιακό γονιδίωμα ολιγονουκλεοτιδικής αλληλουχίας IS6110, ως επιδημιολογικού δείκτη, γνώρισαν ευρεία εφαρμογή στην τυποποίηση κλινικών στελεχών Μ. tuberculosis6,7. Μεταξύ αυτών, η RFLP είναι η πιο διαδεδομένη6,8, αν και υπάρχουν και άλλες μέθοδοι που μπορούν να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά ή κάτω από ορισμένες συνθήκες όπως η spoligotyping και η randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)9,10. Στη παρούσα μελέτη, στόχος ήταν η σύγκριση δύο διαφορετικών μοριακών τεχνικών για την τυποποίηση στελεχών Μ. tuberculosis που απομονώθηκαν στο Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων: Η ανάλυση RAPD με συνδυασμό τριών εκκινητών (primers) ή με έναν primer και η ανάλυση RFLP με μη ραδιοσημασμένο ανιχνευτή (probe) IS6110.

ΥΛΙΚΟ - ΜΕΘΟΔΟΣ

Στελέχη Μ. tuberculosis

Με την ανάλυση RFLP τυποποιήθηκαν 25 ευαίσθητα στελέχη Μ. tuberculosis από ασθενείς που, από το ιστορικό τους, φαινόταν ότι δεν είχαν σχέση μεταξύ τους. Με την μέθοδο RAPD μελετήθηκαν 17 ανθεκτικά στη ριφαμπικίνη και 43 ανθεκτικά στην ισονιαζίδη στελέχη Μ. tuberculosis, ομοίως άσχετα μεταξύ τους. Και με τις δύο μεθόδους μελετήθηκαν τρία στελέχη από ασθενείς της ίδιας οικογένειας και έξι στελέχη από ασθενείς τριών διαφορετικών οικογενειών. Τέλος, τα 25 στελέχη που τυποποιήθηκαν με την RFLP, τυποποιήθηκαν και με την RAPD με τον IRIS primer. Όλα τα στελέχη απομονώθηκαν σε διάστημα δύο χρόνων (1997-1998).

Απομόνωση DNA Μ. tuberculosis

Μεμονωμένες αποικίες Μ. tuberculosis, σε σωληνάρια L-J, ανακαλλιεργήθηκαν σε ζωμό Middlebrook 7Η9, εμπλουτισμένο με 10% OADC. Ακολούθησε φυγοκέντρηση και απομόνωση του DNA των μυκοβακτηριδίων από το ίζημα, με τη χρησιμοποίηση της ρητίνης Chelex (Perkin Elmer, New Jersey, USA). Συγκεκριμένα, το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε απεσταγμένο νερό και σε αυτό προστέθηκε διπλάσιος όγκος αντιδραστηρίου. Ακολούθησε θέρμανση στους 95°C επί 25-30min για το σπάσιμο του μυκοβακτηριδιακού κυττάρου, φυγοκέντρηση και αποχωρισμός του υπερκείμενου, το οποίο περιείχε το DNA11.

Ανάλυση Restriction fragment length polymorphism (RFLP)

Το DNA του μυκοβακτηριδίου επωάστηκε με το περιοριστικό ένζυμο PstI επί 18 ώρες και διαχωρίστηκε ηλεκτροφορητικά σε 0.8% γέλη αγαρόζης. Η γέλη επωάστηκε μία φορά σε 0.25Μ HCI επί 15min, δύο φορές σε 1.5Μ Nacl-0.5Μ ΝαΟΗ, 15min έκαστη, και δυο φορές σε ΙΜ CH3COONΗ4, 15min έκαστη. Μετά την μεταφορά του DNA σε φίλτρο Hybond Ν (Amersham), έγινε υβριδισμός με IS6110 probe σημασμένο με acetoxy-acetylaminolluorene (AAF-IS6110). Για την ανίχνευσή του χρησιμοποιήθηκε αρχικά anti-AAF αντίσωμα (Eurogentec), στη συνέχεια alcaline phosphatase-anti-αντίσωμα (Biosys) και τελικά το ανάλογο υπόστρωμα12.

Ανάλυση Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Η RAPD ή Arbitrarily primed PCR (PCR αυθαίρετων εκκινητών, ΑΡ-PCR) είναι μέθοδος DNA δακτυλικών αποτυπωμάτων (fingerprinting), η οποία έχει δυο σημαντικές διαφορές από την κλασική PCR: 1) προστίθεται ένας primers μικρού μεγέθους (-10bp), αντί για ζεύγος, και 2) η θερμοκρασία σύνδεσης (annealing) είναι χαμηλή (36-45°C), αντί για 55-60°C. Αποτέλεσμα είναι η σύνδεσή του primer σε διάφορες θέσεις και στις δύο έλικες του DNA στόχου. Με τον τρόπο αυτό γεννιούνται διάφορα τμήματα DNA τα οποία διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά και μπορεί έτσι να τυποποιηθούν διάφορα μικρόβια11.

Οι primers που επιλέχθηκαν ήταν τέσσερις: Ο Α1245 (5’GCCGCCGAAACGATCTAC-3', αποτελέσματα με κεφαλαία γράμματα), ο Β1245 (5'-AGGTGGCGTCGAGGAAGAC-3', αποτελέσματα με αριθμούς), ο Leg2 (5’CTGGCTTCTTCCAGCTTCA-3', αποτελέσματα με μικρά γράμματα) και ο ΙRIS με 5'-GAGTCTCCGGAC(Α+Τ)(C+Τ)(A+G)CCGGGGCGGTTCA-3', αποτελέσματα με πλάγια γράμματα). Μετά την PCR, τα τμήματα του DNA (fragments) ηλεκτροφορήθηκαν σε γέλη αγαρόζης 2% w/ν με ενσωματωμένο σε αυτή βρωμιούχο εθίδιο. Τα διαφορετικά ηλεκτροφορητικά profiles έγιναν ορατά με υπεριώδη ακτινοβολία, φωτογραφήθηκαν και συγκρίθηκαν μεταξύ τους. Διαφορά σε τουλάχιστον μία μπάντα θεωρήθηκε ως διαφορετικό profile, ενώ διαφορά στην ένταση δεν λήφθηκε υπ’ όψη.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Στην παρούσα εργασία εφαρμόστηκαν δύο διαφορετικές μέθοδοι μοριακής τυποποίησης κλινικών στελεχών Μ. tuberculosis που απομονώθηκαν στο Εθνικό Kέντρο Αναφοράς Μυκοβακτηριδίων. Η μέθοδος RFLP χρησιμοποιήθηκε για τυποποίηση ευαίσθητων και η RAPD ανθεκτικών, άσχετων μεταξύ τους, στελεχών. Σχετιζόμενα στελέχη, από επιδημίες φυματίωσης εντός οικογενειών, τυποποιήθηκαν και με τις δύο μεθόδους: IS6110-RFLP και RAPD, με μόνο τον DUS primer.

Η μοριακή τυποποίηση ήταν επιτυχής και με τις δύο μεθόδους. Τα 25 άσχετα στελέχη παρουσίασαν πολυμορφισμό με την RFLP και RAPD (IRIS primer), ενώ τα σχετιζόμενα στελέχη ήταν ίδια με ανάλυση RFLP και RAPD (IRIS και συνδυασμός τριών άλλων primers). Στη μελέτη μας, σχετιζόμενα και μη στελέχη παρουσίαζαν περισσότερες από 6 μπάντες. Αν και όλα τα στελέχη που τυποποιήθηκαν με RFLP ήταν ευαίσθητα, έχει δειχθεί από προηγούμενη μελέτη ότι δεν υπάρχει συσχέτιση του RFLP profile και του φαινοτύπου αντοχής12.

Η συσχέτιση των αποτελεσμάτων της RAPD με το συνδυασμό των τριών primers και του είδους της μετάλλαξης στο rpoB γονίδιο, προκειμένου για τα ανθεκτικά στη ριφαμπικίνη στελέχη, έδειξε καθαρά ότι στελέχη με τα ίδια rpoB αλλήλια μπορεί να έχουν διαφορετικά RAPD profiles (π.χ. στελέχη Ν322 και Ν836) και στελέχη με το ίδιο RAPD profile μπορεί να έχουν διαφορετικά rpoB αλλήλια (π.χ. στελέχη Ν98 και Ν217) (πιν. 1)13. Το ίδιο συμβαίνει και με τα ανθεκτικά στην ισονιαζίδη στελέχη, προκειμένου για το katG γονίδιο (πιν. 2). Αυτό σημαίνει ότι κλωνικά σχετιζόμενα μεταξύ τους στελέχη, μπορεί να χωρίζονται σε υποκλώνους με διαφορετικές μεταξύ τους μεταλλάξεις στα rpoΒ και katG γονίδια, και ίδιες μεταλλάξεις στα γονίδια αυτά μπορεί να υπάρχουν σε άσχετα στελέχη M. tuberculosis. Όταν χρησιμοποιήθηκε ο IRIS primer, όλα τα ανθεκτικά στη ριφαμπικίνη και στην ισονιαζίδη στελέχη είχαν διαφορετικά profiles, πράγμα που επιβεβαιώνει αυτό που επισημάναμε προηγουμένως: Στελέχη με τις ίδιες μεταλλάξεις στα rpoβ και katG γονίδια ήταν άσχετα μεταξύ τους.

Ο IS6110 θεωρείται ως ο σπουδαιότερος επιδημιολογικός δείκτης του Μ. tuberculosis. Κάθε στέλεχος Μ. tuberculosis έχει πολλά αντίγραφα της εμβόλιμης ακολουθίας IS6110. Η διακριτική ικανότητα επομένως της ΙS6110 RFLP αυξάνει ανάλογα με τον αριθμό των αντιγράφων14 και μένει να εξετασθεί η περίπτωση ομάδων στελεχών με μικρό αριθμό μπαντών. Πρόσφατα περιγράφηκαν μέσα στο γονιδίωμα του Μ. tuberculosis εμβόλιμες ακολουθίες (IS) με νουκλεοτιδική αλληλουχία ανάλογη του IS611015. Έτσι λοιπόν, μερικές μη ειδικές αντιδράσεις, σε στελέχη με μικρό αριθμό IS6110 αντιγράφων, μπορεί να ευνοηθούν με την ελάττωση της θερμοκρασίας υβριδισμού16.




Στη μελέτη μας, εκτός από τη μέθοδο RFLP, η ανάλυση RAPD με τη χρησιμοποίηση διαφόρων εκκινητών τυποποίησε επίσης με επιτυχία τα υπό εξέταση στελέχη. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα των διαφόρων primers, είδαμε ότι ήταν απαραίτητος ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων των τριών primer Α1245/B1245/Leg1 για την τυποποίηση των στελεχών, ενώ ο IRIS είχε την ικανότητα αυτή από μόνος του. Επίσης, για την πλήρη διάκριση των ανθεκτικών στελεχών, ήταν απαραίτητη η γνώση των μεταλλάξεων στα υπεύθυνα γονίδια. Το επίπεδο βέβαια διαχωρισμού ήταν υψηλότερο με τη χρησιμοποίηση του IRIS, σε σχέση με τους άλλους τρεις primers. Ο IRIS είναι 28-μερές σε σύγκριση με τους άλλους primers που είναι 18-μερή, ενώ είναι ο μόνος που έχει 3 μικτές βάσεις. Η τυποποίηση του Μ. tuberculosis με τον IRIS είναι ανάλογη με αυτή της ERIC-PCR με την οποία επιτυγχάνεται ανώτερη διαφοροποίηση, παρά με τη βοήθεια του IS611017.

Συμπερασματικά, η αποτελεσματικότητα και των δύο μεθόδων ήταν ικανοποιητική, αφού πέτυχαν να τυποποιήσουν σχετικά και άσχετα στελέχη Μ. tuberculosis. Συγκρινόμενες μεταξύ τους, ως προς την ευκολία και το κόστος, η μέθοδος RAPD, με τη χρησιμοποίηση του IRIS primer, φαίνεται να υπερτερεί. Γενικά, επειδή η RAPD είναι μέθοδος που εξαρτάται από τις εκάστοτε συνθήκες, σε ένα εργαστήριο αναφοράς μπορεί να εφαρμοστεί πάντα με την προϋπόθεση ότι τα υπό εξέταση στελέχη θα μελετούνται ταυτόχρονα και κάτω από τις ίδιες συνθήκες PCR.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Sepkowitz KA, Raffalli J. Tuberculosis at the end of twentieth century. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994, 13:902-907.
2. Riley LW. Drug-resistant tuberculosis. Clin Infect Dis 1993, 17(SuppI 2): S442-S446.
3. Musser JM. Antimicrobial agent resistance in mycobacteria: molecular genetic insights. Clin Microbiol Rev 1995, 8:496-514.
4.Τουμπής Μ. Σύγχρονα επιδημιολογικά δεδομένα της φυματίωσης. Στο: Σύγχρονες απόψεις για τη φυματίωση. Κλινικά Φροντιστήρια. Ιατρική Εταιρεία Αθηνών (εκδ), Αθήνα 1998, τόμος 10, τεύχος 3, σελ. 9-19.
5. Wellstood S. Diagnostic mycobacteriology: current challenges and technologies. Lab Med 1993, 24:357-361.
6. Swaninathan B, Matar G. Molecular typing methods. In: Percing DH, Smith TF, Tenover FC, White TJ (eds). Diagnostic Molecular Microbiology Principles and Applications. American Society for Microbiology, Washington D.C. 1993, p: 26-50.
7. Mazurek GH, Cave DM, Eisenach KD, Wallace RJ, Bates JH, Crawford JT. Chromosomal DNA fingerprinting patterns produced with IS6110 as strain-specific markers for epidemiologic study of tuberculosis. J Clin Microbiol 1991, 29:2030-2033.
8. Otal l, Martin C, Vincent V, Frebault L, Thierry D, Gicquel B. Restriction fragment length polymorphism analysis using IS6110 as an epidemiological marker in tuberculosis. J Clin Microbiol 1991, 29:1252-1254.
9. Wilson S, Goss S, Drobniewski F. Evaluation of strategies for molecular fingerprinting for use in the routine work of mycobacterium reference unit. J Clin Microbiol 1998, 36:3385-3388.
10. Welsh J, McClelland M. Characterization of pathogenic microorganisms by genomic fingerprinting using Arbitrarily Primed PCR. In: Percing DH, Smith TF, Tenover FC, White TJ (eds). Diagnostic Molecular Microbiology Principles and Applications. American Society for Microbiology Washington D.C. 1993, p.595-602.
11. Matsiota-Bernard P, Waser S, Tassios PT, Kyriakopoulos A, Legakis NJ. Rapid discrimination of Mycobacterium avium strains from AIDS patients by randomly amplified polymorphic DNA analysis. J Clin Microbiol 1997, 35:1585-1588.
12. Thierry D, Matsiota-Bernard P, Pitsouni E, Kostopoulos C, Guesdon JL. Use of the insertion element IS6110 for DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis isolates presenting various profiles of drug susceptibility. FEMS Immunol Med Microbiol 1993, 6:287-297.
13. Matsiota-Bernard P, Vrioni G, Marinis E. Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Greece. J Clin MicrobioI 1998, 36:20-23.
14. Fomukong N, Beggs M, Hajj H. Differences in the presence of IS611 insertion sites in Mycobacterium tuberculosis strains: low and high copy number of IS6110. Tuber Lung Dis 1997, 78:109-116.
15. Cole ST, Brosch R, Parkhill J et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 1998, 393:537-544.
16. Wilson SM., Gross S, Drobnewski F. Evaluation of strategies for molecular fingerprinting for use in the routine work of a Mycobacterium reference unit. J Clin Microbiol 1998, 36:3385-3388.
17. Sechi LA, Zanetti S, Dupre I, Dekogu G, Fadda G. Enterobacterial repetitive intergenic consensus as molecular targets for typing of Mycobacterium tuberculosis strains. J Clin Microbiol 1998, 36:128-132.
© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE