Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Τα επίπεδα του υπεροξειδίου του υδρογόνου στον εκπνεόμενο αέρα ασθενών με βρογχεκτασίες: Σχέση με τη φλεγμονή και τη βαρύτητα και έκταση της νόσου
ΠΕΡΙΛΗΨΗ: Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) έχει προταθεί ως δείκτης φλεγμονής των αεραγωγών σε διάφορες πνευμονικές παθήσεις συμπεριλαμβανομένων των βρογχεκτασιών. Ο ρόλος του όμως εξακολουθεί να παραμένει αδιευκρίνιστος, εξ αιτίας της απουσίας ειδικών συσχετίσεων με φλεγμονώδεις παράγοντες που προέρχονται απο βιοψικά υλικά ή από υλικά μελέτης κυτταρικού πληθυσμού. Μελετήσαμε τα επίπεδα του H2O2 στο συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα 30 ασθενών με βρογχεκτασίες (24 άνδρες, ηλικίας 39 ± 12 2.5 έτη, FEV1 69 ± 12 4% αναμ.), ερευνώντας την πιθανή συσχέτισή τους με την έκταση της νόσου, όπως αυτή καθορίσθηκε με την υψηλής διακριτικότητας αξονική τομογραφία (HRCT), τη σπιρομέτρηση, καθώς και την σύνθεση του κυτταρικού πληθυσμού μετά προκλητή απόχρεμψη. Στους ίδιους ασθενείς μελετήθηκαν οι ίδιες παράμετροι, μεταξύ αυτών που ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή συγκριτικά με αυτούς που δεν ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή. Τα επίπεδα του H2O2 στο συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχεκτασίες ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα συγκρινόμενα με αυτά 15 φυσιολογικών ατόμων (12 άνδρες, ηλικίας 34 ± 12 4 έτη, FEV1 95 ± 12 3 % αναμ.) (1.1 ± 12 0.1 μM έναντι 0.3 ± 12 0.04 μM, p<0.0001). Παρατηρήθηκε μία στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ H2O2, του επί % αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στην προκλητή απόχρεμψη και της έκτασης της νόσου όπως αυτή καθορίσθηκε με το σύστημα βαθμολόγησης της HRCT (r=0.9, p<0.0001 και r=0.66, p<0.0001 αντίστοιχα). Βρέθηκε ακόμα μία στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτηση μεταξύ H2O2 και FEV1, % αναμ. (r=-0.42, p<0.05). Οι ασθενείς που ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή σε σύγκριση με τους μη λαμβάνοντες στεροειδή, δεν παρουσίαζαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ως προς τα επίπεδα του H2O2 (1.15 ± 12 0.15 μM έναντι 1.02 ± 12 0.1 μM, p=0.12). Συμπερασματικά, η μελέτη των επιπέδων του H2O2 στο συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχεκτασίες μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης φλεγμονής των αεραγωγών, έκτασης της νόσου και εν μέρει της βαρύτητας απόφραξης των αεραγωγών. Πνεύμων 2000, 13 (2): 144-153

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Οι βρογχεκτασίες αποτελούν μία χρόνια νόσο των αεραγωγών που χαρακτηρίζεται από μη αναστρέψιμη διάταση των βρόγχων και μόνιμη παραγωγή βλεννοπυώδους απόχρεμψης. Σε ασθενείς με βρογχεκτασίες έχουν μετρηθεί υψηλά επίπεδα κυτταροκινών στις βρογχικές εκκρίσεις, ενώ τα πολυμορφοπύρηνα θεωρούνται ως τα επικρατούντα κύτταρα στην φλεγμονή των αεραγωγών1. Η βλάβη των αεραγωγών θεωρείται ότι οφείλεται σε παρατεταμένη απελευθέρωση φλεγμονωδών μεσολαβητών που προέρχονται από τα πολυμορφοπύρηνα, ως απάντηση στις επαναλαμβανόμενες βακτηριδιακές λοιμώξεις2. Η αξιολόγηση και παρακολούθηση των ασθενών γίνεται με τις λειτουργικές δοκιμασίες του αναπνευστικού, με κυριώτερο εκπρόσωπο την απλή σπιρομέτρηση, καθώς και με την υψηλής διακριτικότητας αξονική τομογραφία (HRCT), παρ’ότι η τελευταία απαιτεί έκθεση σε ακτινοβολία3. Πολλές μελέτες έχουν ασχοληθεί με τη συσχέτιση συστηματικών δεικτών φλεγμονής-που μετρήθηκαν στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (ΒΑL), στον ορό ή στον εκπνεόμενο αέρα- με την έκταση της νόσου, τις λειτουργικές δοκιμασίες, τη σύνθεση και την ποσότητα των πτυέλων καθώς και την ποιότητα ζωής των ασθενών4-6.

Μέσω της διαδικασίας της βρογχοσκόπησης, η φλεγμονή των αεραγωγών αξιολογείται με την κυτταρολογική και βιοχημική ανάλυση του ΒΑL ή με την μελέτη βιοψικού υλικού. Εξ αιτίας όμως του επεμβατικού χαρακτήρα της, η βρογχοσκόπηση δεν θεωρείται η κατάλληλη μέθοδος για επαναλαμβανόμενες μετρήσεις. Η πρόσφατη έρευνα θεωρεί ότι η προκλητή απόχρεμψη αποτελεί μία αξιόπιστη, μη επεμβατική και εύκολη μέθοδο για την αξιολόγηση της φλεγμονής των αεραγωγών7. Η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί και σε σοβαρές καταστάσεις, ενώ είναι ευκόλως επαναλαμβανόμενη, με μεγάλη αξία στην έρευνα της φλεγμονώδους διεργασίας, καθώς και στην θεραπευτική αξιολόγηση των διαφόρων πνευμονικών παθήσεων8.

Το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2) αποτελεί ένα σημαντικό οξειδωτικό μόριο που προκαλεί κυτταρική βλάβη. Το H2O2 έχει προταθεί ως δείκτης φλεγμονής σε διάφορες πνευμονικές παθήσεις, συμπεριλαμβανομένων των βρογχεκτασιών9-12. Παρά όμως την εκτεταμένη κλινική και εργαστηριακή του διερεύνηση, δεν υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι σχετίζεται με τη διαδικασία της φλεγμονής των αεραγωγών. Αυτό οφείλεται κυρίως στην απουσία συσχετίσεων μεταξύ H2O2 και δεικτών φλεγμονής που να προέρχονται από βιοψικά υλικά ή από την μελέτη κυτταρικού πληθυσμού των αεραγωγών.

Με βάσει την παραπάνω υπόθεση, μελετήσαμε τα επίπεδα του H2O2 στο συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα ασθενών με βρογχεκτασίες, ερευνώντας συγχρόνως την ύπαρξη πιθανής συσχέτισης μεταξύ H2O2, έκτασης της νόσου, λειτουργικών δοκιμασιών και κυτταρικού πληθυσμού από την προκλητή απόχρεμψη. Τέλος, οι ίδιες παράμετροι συγκρίθηκαν μεταξύ ασθενών που ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή και αυτών που δεν ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή.



ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ

Μελετήθηκαν 15 φυσιολογικά άτομα (12 άνδρες, ηλικία 34 ± 4 έτη) (Πίνακας 1). Όλοι ήταν μη καπνιστές και δεν παρουσίαζαν λοίμωξη αναπνευστικού επί τουλάχιστο έξι εβδομάδες πριν από την συμμετοχή τους στη μελέτη. Δεν είχαν ιστορικό χρόνιας νόσου και δεν ελάμβαναν χρόνια φαρμακευτική αγωγή. Όλοι οι ασθενείς παρουσίαζαν αρνητική δοκιμασία ορού για παρουσία ατοπίας (phadiatop test). Όλοι είχαν φυσιολογική σπιρομέτρηση (FEV1 95 ± 3 % αναμ. και FVC 97 ± 5 % αναμ.) και δεν παρουσίαζαν βρογχική υπεραντιδραστικότητα, όπως αυτή μετρήθηκε με δοκιμασία πρόκλησης με ισταμίνη (PD20 >0.800mg).

Τριάντα ασθενείς (24 άνδρες, ηλικίας 39 ± 2.5 έτη, FEV1 69 ± 4 % αναμ.) με διαγνωσμένες βρογχεκτασίες επιλέχθηκαν από τα εξωτερικά ιατρεία του 401 ΓΣΝΑ. Η διάγνωση των ασθενών βασίσθηκε σε κλινικά και ακτινολογικά κριτήρια, ενώ τεκμηριώθηκε με HRCT. Οι ασθενείς συμμετείχαν στην μελέτη μόνο αν ήταν σε σταθερή κλινική κατάσταση και δεν παρουσίαζαν λοίμωξη του ανώτερου ή κατώτερου αναπνευστικού επί τουλάχιστον 4 εβδομάδες πριν την μελέτη. Οι βρογχεκτασίες θεωρήθηκαν μεταφυματιώδεις σε έναν ασθενή, λόγω πρωτοπαθούς δυσκινησίας των κροσσών σε τρείς ασθενείς, σύνδρομο Young σε ένα, ανεπάρκεια υποκλάσματος ΙgG σε δύο ασθενείς, ανεπάρκεια ΙgΑ σε έναν ασθενή, ενώ στους εναπομείναντες είκοσι-δύο, λόγω μη ανευρέσεως προφανούς αιτίας, εδόθη ο χαρακτηρισμός ιδιοπαθής. Όλοι οι ασθενείς σε ανάλογη χρονική περίοδο είχαν ελεγχθεί για ύπαρξη ινοκυστικής νόσου με αρνητικά αποτελέσματα. Ασθενείς με βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση, άσθμα και ατοπία αποκλείσθηκαν από την μελέτη. Κανένας από τους ασθενείς δεν ήταν καπνιστής, ενώ δύο από αυτούς είχαν σταματήσει το κάπνισμα από 3ετίας (ιστορικό καπνίσματος < 4 pack-years). Είκοσι ένας ασθενείς ελάμβαναν β2 διεγέρτες, 2 ελάμβαναν βρωμιούχο ιπρατρόπιο, ενώ 14 ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή (προπιονική φλουτικαζόνη 500-1000μg ή βουδεσονίδη 400-800 μg ημερησίως). Κανείς ασθενής δεν ελάμβανε βλεννολυτικά ή ευρίσκετο σε χρόνια οξυγονοθεραπεία. Κανείς ασθενής δεν είχε αναστρεψιμότητα στην σπιρομέτρηση (αύξηση της FEV1 τριάντα λεπτά μετά από εισπνοή 200μg σαλβουταμόλης <10%).

Σχεδιασμός μελέτης

Σε όλα τα φυσιολογικά άτομα ελήφθη ιατρικό ιστορικό, έγινε φυσική εξέταση, σπιρομέτρηση και δοκιμασία βρογχικής πρόκλησης με ισταμίνη. Μετά από την διενέργεια της σπιρομέτρησης, έγινε η συλλογή του εκπνεόμενου αέρα. Τριάντα λεπτά αργότερα η σπιρομέτρηση επαναλήφθηκε και εφ’ όσον δεν παρουσίαζε μεταβολές, ακολουθούσε η διαδικασία της προκλητής απόχρεμψης. Ο ερευνητής που έκανε τις μετρήσεις του H2O2 καθώς και ο ερευνητής που ανέλυε τα ευρήματα της προκλητής απόχρεμψης δεν γνώριζαν την κλινική και λειτουργική εικόνα ούτε των ασθενών ούτε των φυσιολογικών ατόμων.

Λειτουργικές δοκιμασίες

Η μέτρηση της FEV1 και FVC έγινε με σπιρόμετρο Vica-test, Mignhard, NL. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκε η καλύτερη προσπάθεια από τρεις εκφραζόμενη σε % της αναμενομένης. Η βρογχική υπεραντιδραστικότητα μετρήθηκε με δοκιμασία πρόκλησης με ισταμίνη χρησιμοποιώντας το σύστημα APS Jaeger, Wόrzburg, Germany με νεφελοποιητή Sandoz (Jaeger). Η PD20 μετρήθηκε ως η δόση ισταμίνης που προκαλεί πτώση της FEV1 κατά 20%.

Υψηλής διακριτικότητας αξονική τομογραφία

Oι 30 ασθενείς υπεβλήθησαν σε HRCT (GE 9800 Highlight advanced) με χρονικό όριο τις 10 ημέρες από την συμμετοχή στην μελέτη. Η HRCT αξιολογήθηκε και βαθμολογήθηκε από τον ίδιο ακτινολόγο ο οποίος δεν γνώριζε στοιχεία από τις παραμέτρους που εξετάσθηκαν στην παρούσα μελέτη. Και στους δύο πνεύμονες κάθε λοβός αξιολογήθηκε για βρογχεκτασικές αλλοιώσεις με σύστημα βαθμολόγησης από 0-3 (η γλωσσίδα βαθμολογήθηκε ως ξεχωριστός λοβός). Μέγιστη βαθμολογία ήταν 18 βαθμοί (0= καμμία αλλοίωση 1=συμμετοχή ενός υποτμηματικού, 2=συμμετοχή περισσότερο από ένα υποτμηματικό, 3=παρουσία κυστικών βρογχεκτασιών). Η παραπάνω αξιολόγηση είναι απόλυτα τεκμηριωμένη στην βιβλιογραφία και συνοδεύεται από χαμηλη παρέκλιση3,5. Στο διάστημα των 10 ημερών κανείς ασθενής δεν παρουσίασε μεταβολές της κλινικής του κατάστασης ή της σπιρομέτρησης.

Συλλογή συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα και μέτρηση υπεροξειδίου του υδρογόνου

Η συλλογή του συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα έγινε σε πρωινές ώρες χρησιμοποιώντας μία εναλλακτική μέθοδο ψύξεως των σωλήνων. Το μηχάνημα που χρησιμοποιείται για την πρόκληση με ψυχρό αέρα λειτούργησε στη συγκεκριμένη μέθοδο ως μέσο παραγωγής ψυχρού αέρα σε θερμοκρασίες –150 C έως -180 C με ροή αέρα 80λίτρα/λεπτό. Ένα διπλός γυάλινος σωλήνας μήκους 30 cm συνδέθηκε με το σημείο εξόδου του ψυχρού αέρα από το ένα άκρο, ενώ στο άλλο άκρο γινόταν η εκπνοή των ατόμων της μελέτης. Ο σωλήνας στο επάνω μέρος είχε μία βαλβίδα 2 κατευθύνσεων (Ηeins Rudolf) με σκοπό να ξεχωρίζει την εισπνοή από την εκπνοή. Όλοι οι συμμετέχοντες στην μελέτη, πριν ξεκινήσουν την διαδικασία συλλογής του συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα, έκαναν στοματοφαρυγγικές πλύσεις με νερό, ενώ η διαδικασία συλλογής έγινε σε καθιστική θέση με ήρεμη αναπνοή και επί χρονικό διάστημα 10 λεπτών. Το συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα συλλέχθηκε στο άκρο που ήταν συνδεδεμένο με το μηχάνημα του ψυχρού αέρα και άμεσα διατηρήθηκε στους –70 0 C για την μετέπειτα επεξεργασία. Σύμφωνα με αυτή την μέθοδο τα πλεονεκτήματα είναι δύο: Πρώτον αποφεύγεται η ανάμειξη με σίελο λόγω του ότι η συλλογή γίνεται στο άλλο άκρο του σωλήνα που βρίσκεται 30 cm μακρύτερα από το στόμα του ασθενούς. Το δεύτερο είναι η διατήρηση σταθερής θερμοκρασίας ψύξεως του δείγματος μέσω του μηχανήματος του ψυχρού αέρα, σε σύγκριση με το μέχρι τώρα χρησιμοποιούμενο πάγο των άλλων μεθόδων. Με την παραπάνω μέθοδο συλλέγεται τουλάχιστο 1ml εκπνεόμενου αέρα σε πλαστικό σωληνάριο χωρητικότητας 3ml. Η μέτρηση του H2O2 έγινε σε διάστημα 20 ημερών από την στιγμή της συλλογής. Οι μετρήσεις έγιναν σε 4 ομάδες (μικρότερος χρόνος μέτρησης 2 ημέρες –μεγαλύτερος χρόνος μέτρησης από την συλλογή 20 ημέρες). Όλα τα δείγματα ελέγχθησαν για την παρουσία σιέλου με την μέθοδο ανίχνευσης της αμυλάσης. Η ανίχνευση αμυλάσης έγινε με την φασματοφωτομετρική μέθοδο χρησιμοποιώντας ως αντιδραστήριο το KONE Instr. Finland. Με αυτή την μέθοδο η αμυλάση του δείγματος και το ένζυμο α-γλυκοσιδάση υδρολύουν το υπόστρωμα π-νιτροφενυλο-α-δ μαλτοχεπταοσίδη σε γλυκόζη και π-νιτροφενόλη. Ακολουθεί η απελευθέρωση της π-νιτροφενόλης στα 405ηm (370 C) για 2 λεπτά. Σε δύο δείγματα έγινε έγχυση σιέλου με σκοπό να ελεγχθεί η ευαισθησία της μεθόδου. Χρησιμοποιώντας την μέθοδο που περιγράφηκε, δεν ανευρέθηκε αμυλάση σε κανένα από τα δείγματα της μελέτης. Στα δείγματα που έγινε έγχυση σιέλου ανευρέθη αμυλάση > των 5000 IU. Η αναπαραγωγιμότητα των επιπέδων του H2O2 ελέγχθηκε σε 2 διαφορετικές ημέρες σε 5 φυσιολογικούς και σε δέκα ασθενείς που επιλέχθηκαν τυχαία. Για τον έλεγχο σταθερότητας του δείγματος χρησιμοποιήθηκαν 8 άτομα (4 ασθενείς). Στα παραπάνω άτομα ελήφθησαν 4 ml δείγματος. Αυτή η ποσότητα χωρίσθηκε σε 4 ίσα μέρη και η μέτρηση του H2O2 έγινε σε χρονικό διάστημα 2ημερών,1 εβδομάδας, 2 εβδομάδων και 3 εβδομάδων που αποτελεί και το μέγιστο χρόνο μέτρησης που χρησιμοποιήθηκε για όλα τα δείγματα.

Για την μέτρηση του H2O2 χρησιμοποιήθηκε η μέχρι τώρα αποδεκτή ενζυματική μέθοδος11,13. Περιληπτικά, 250 l από 420 M 3’, 3,5,5’ τετραμεθυλβενζιδίνη (διαλυμμένη σε 0.42 M citrate buffer, pH 3.8) και 10 l από 52.5 U/ml horseradish περοξιδάση (HRP, Sigma Chemicals, St Louis, USA) αναμίχθηκαν με 250 l δείγματος εκπνεόμενου αέρα για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το μείγμα αυτό οξειδώθηκε σε pH 1 με 10 l από 18 N σουλφουρικό οξύ. Το προιόν μετατροπής προσδιορίσθηκε ποσοτικά με απορρόφηση σε 450 nm χρησιμοποιώντας διπλό φασματοφωτόμετρο (Uvicon 940, Kontron Instr.) και τελικά μετρήθηκε με αυτόματο αναλυτή (model EL 312 Biotec). Tο κατώτερο όριο μέτρησης ήταν 0.1 M H2O2.

Προκλητή απόχρεμψη

Η προκλητή απόχρεμψη έγινε σύμφωνα με την μέθοδο που έχει περιγραφεί στη βιβλιογραφία14, λαμβάνοντας όλα τα προληπτικά μέτρα για την ασφάλεια της μεθόδου8. Χρησιμοποιήθηκε εισπνοή υπέρτονου φυσιολογικού ορού 3.5% με νεφελοποιητή DeVilbiss ultrasonic (2696 Somerset PA, USA). Σε ασθενείς και φυσιολογικούς ζητήθηκε να καθαρίσουν τις ρινικές τους εκκρίσεις και να κάνουν καλές στοματοφαρυγγικές πλύσεις με σκοπό να μειωθεί η πιθανότητα ανάμειξης του δείγματος πτυέλου με οπισθορρινικές εκκρίσεις και σίελο. Κατά την διάρκεια της διαδικασίας όλα τα άτομα της μελέτης έφεραν ρινοπίεστρο. Σε όλους ζητήθηκε να βήχουν βαθειά με χρονικά διαλείμματα 2-3 λεπτών, ανάλογα φυσικά και με την λειτουργική βαρύτητα της νόσου. Το πρώτο δείγμα πτυέλων δεν χρησιμοποιήθηκε μιας και θεωρείται ότι περιέχει υψηλό ποσοστό πλακωδών κυττάρων15. Ελήφθησαν τουλάχιστον 2 ml προκλητής απόχρεμψης σε πλαστικό σωληνάριο. Το δείγμα θεωρήθηκε αξιόπιστο εφ΄όσον τα πλακώδη κύτταρα ήταν < 30% του συνόλου των φλεγμονωδών κυττάρων. Η διεργασία του δείγματος έγινε σε χρονικό διάστημα 2 ωρών από την συλλογή του. Εν συντομία περιγράφουμε την διαδικασία προετοιμασίας και ανάγνωσης του δείγματος. Αλατούχο διάλυμα Hanks’ (HBSS 2ml) που περιείχε 1% διθιοτριόλη (DTT: Sigma Chemicals, St Louis, USA) αναμείχθηκε με το δείγμα πτυέλων. Κατόπιν ανακινήθηκε αρκετές φορές μέχρι την πλήρη ομογενοποίησή του. Ακολούθησε καταγραφή του όγκου του πτύελου και νέα ανάμειξη με το HBSS με σκοπό το συνολικό δείγμα να γίνει 10 ml. Ακολούθησε νέα ανακίνηση και φυγοκέντρηση για 10 λεπτά σε 400 x g. Χρησιμοποιώντας ανάλογο μετρητή και μετά από χρώση με kimura έγινε η προετοιμασία του δείγματος για μέτρηση του συνολικού αριθμού των φλεγμονωδών κυττάρων. Τα τελικά δείγματα μετρήθηκαν μετά από χρώση με May-Grunwald-Giemsa. Χρησιμοποιήθηκαν 2 πλακίδια ενώ μετρήθηκαν τουλάχιστον 300 φλεγμονώδη κύτταρα. Όταν έγινε η μέτρηση της επί τοις εκατό ανάλυσης του κυτταρικού πληθυσμού δεν ήταν γνωστές οι τιμές του H2O2.

Στατιστική ανάλυση

Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή SEM. Για την στατιστική σύγκριση των ομάδων χρησιμοποιήθηκε το student-t-test. Η στατιστική συσχέτιση έγινε με το σύστημα Spearman’s rank correlation coefficients. Η αναπαραγωγιμότητα των επιπέδων του H2O2 καθώς και η σταθερότητα των δειγμάτων ελέγχθηκαν με την μέθοδο που έχει περιγραφεί στην βιβλιογραφία16. Το p <0.05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντικό.



ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Χρησιμοποιώντας την μέθοδο που περιγράφηκε για τον έλεγχο αναπαραγωγιμότητας των μετρήσεων βρέθηκε ότι οι τιμές των δύο συνεχόμενων ημερών είχαν διαφορά 0.07 (SD 0.04) για τους ασθενείς και 0.03 (SD 0.02) για τους φυσιολογικούς. Ο έλεγχος σταθερότητας έδειξε ότι δεν καταγράφηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των 4 μετρήσεων (0.62 ± 0.41 SD στις 2 ημέρες, p=0.67, 0.64 ± 0.4 SD μετά από 1 εβδομάδα, p=0.54, 0.635 ± 0.4 SD μετά από 2 εβδομάδες, p=0.60, 0.64 ± 0.42 SD μετά από 3 εβδομάδες, p=0.55).

Τα επίπεδα του H2O2 βρέθηκαν να είναι στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με βρογχεκτασίες συγκριτικά με τους φυσιολογικούς (1.1 0.1 μM έναντι 0.3 0.04 μM αντιστοίχως, p<0.0001, Εικόνα 1). Ο ολικός αριθμός κυττάρων στην προκλητή απόχρεμψη ήταν σημαντικά υψηλότερος στους ασθενείς με βρογχεκτασίες σε σχέση με τους φυσιολογικούς (3.7 106ml-1 έναντι 2.1 106ml-1, p<0.001). Ο επί τοις εκατό αριθμός των πολυμορφοπυρήνων, όπως αυτά αναλύθηκαν στην προκλητή απόχρεμψη, ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερος στους βρογχεκτασικούς ασθενείς συγκρινόμενα με τους φυσιολογικούς (59 ± 3 % έναντι 27 ± 1.5 % αντιστοίχως p<0.0001, εικόνα 2). Αντίθετα, οι φυσιολογικοί είχαν στατιστικά υψηλότερο αριθμό επί τοις εκατό μακροφάγων (72.5% έναντι 40.3% αντιστοίχως p<0.0001, εικόνα 2). Παρατηρήθηκε μία στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του H2O2 στον εκπνεόμενο αέρα, του επί τοις εκατό αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στην προκλητή απόχρεμψη και της έκτασης της νόσου (r=0.9, p<0.0001, r=0.66, p<0.0001 αντιστοίχως (Εικόνες 3A, 3B). Παρατηρήθηκε ακόμα μία στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ της FEV1 % αναμ., των επιπέδων του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα, του επί τοις εκατό αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στην προκλητή απόχρεμψη και της έκτασης της νόσου (r=-0.42, p<0.05-εικόνα 3Γ, r=-0.39, p<0.05 και r=-0.48, p<0.05, αντιστοίχως). Παρατηρήθηκε μία στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ του επί τοις εκατό αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στην προκλητή απόχρεμψη και της έκτασης της νόσου (r=0.6, p<0.0001). Οι ασθενείς με βρογχεκτασίες παρουσίαζαν μία στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ του επί τοις εκατό αριθμού των μακροφάγων και των επιπέδων του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα (r=-0.64, p<0.0001). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της FVC % αναμ., των επιπέδων του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα, του επί τοις εκατό αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στην προκλητή απόχρεμψη και της έκτασης της νόσου. Τα επίπεδα του H2O2 στους ασθενείς που ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή δεν παρουσίαζαν στατιστικά σημαντική διαφορά με αυτούς που δεν ελάμβαναν ανάλογη αγωγή (1.15 ± 0.15 μM έναντι 1.02 ± 0.1 μM αντιστοίχως, p=0.12, πίνακας 2). Στις δύο αυτές ομάδες αξιολογήθηκαν και οι άλλες παράμετροι της μελέτης χωρίς να προκύψουν στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα (Πίνακας 2).





ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι οι ασθενείς με βρογχεκτασίες παρουσιάζουν αύξηση των επιπέδων του H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα. Η αύξηση αυτή σχετίζεται με την πολυμορφοπυρηνική φλεγμονή στην προκλητή απόχρεμψη, με την έκταση της νόσου καθώς και με την βαρύτητα της απόφραξης όπως αυτή ορίσθηκε με την FEV1 % αναμ.

Τα επίπεδα του H2O2 που μετρήθηκαν σε φυσιολογικά άτομα είναι ανάλογα με αυτά που έχουν αναφερθεί σε άλλες μελέτες9,17. Ανάλογες με προηγούμενη μέτρηση είναι και οι μετρήσεις του H2O2 σε ασθενείς με βρογχεκτασίες12. Πολλές μελέτες έχουν ασχοληθεί με την παρουσία οξειδωτικής φλεγμονής στον εκπνεόμενο αέρα ή και στο συμπύκνωμά του6,12,18. Η κύρια υπόθεση των μελετών αυτών βασιζόταν στην θεωρία ότι τα αυξημένα επίπεδα μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ), μονοξειδίου του άνθρακα (CO) και H2O2 σχετίζονται άμεσα με την διαδικασία της φλεγμονής των αεραγωγών. Η υπόθεση όμως αυτή παρέμεινε αναπόδεικτη μιας και δεν είχαν χρησιμοποιηθεί οι ανάλογες μετρήσεις που θα επιβεβαίωναν αυτή την θεωρία. Με βάση τα προαναφερθέντα, τα αποτελέσματα της μελέτης μας είναι τα πρώτα που επιβεβαιώνουν μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ υψηλών επιπέδων οξειδωτικών μορίων στον εκπνεόμενο αέρα και φλεγμονής των αεραγωγών σε ασθενείς με βρογχεκτασίες.

Τα μετρηθέντα επίπεδα του H2O2 είναι το αποτέλεσμα που προκύπτει μεταξύ της διαδικασίας παραγωγής και της διαδικασίας εξουδετέρωσης από τους αντιοξειδωτικούς παράγοντες. Αν συγκρίνει κανείς την αντιοξειδωτική διαδικασία εξουδετέρωσης σε κυτταρικό επίπεδο με αυτήν που επικρατεί στον εξωκυττάριο χώρο και στους αεραγωγούς, στους τελευταίους υπάρχει σημαντικά μειωμένη ικανότητα αντιοξειδωτικής εξουδετέρωσης των οξειδωτικών μορίων19. Αυτό σημαίνει ότι η φλεγμονή των αεραγωγών που παρατηρείται στις βρογχεκτασίες καθώς και σε άλλες πνευμονικές παθήσεις μπορεί να είναι πιό επιρρεπής στο να παρουσιάζει υψηλή παραγωγή οξειδωτικών μορίων. Αυτό εξηγεί εν μέρει και την παρουσία υψηλών επιπέδων H2O2 στο συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα. Ενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων των βρόγχων, συμπεριλαμβανομένου των πολυμορφοπυρήνων, των ηωσινοφίλων και των μακροφάγων, οδηγεί σε μία εκσεσημασμένη παραγωγή οξειδωτικών μορίων συμπεριλαμβανομένου του H2O220. Ειδικότερα θεωρείται ότι η μεγάλη παραγωγή H2O2 προέρχεται από αύξηση του αριθμού των πολυμορφοπυρήνων21. Η ενεργοποίηση των φλεγμονωδών κυττάρων των βρόγχων και κυρίως των πολυμορφοπυρήνων αποτελεί σημαντικό τμήμα της φλεγμονώδους διαδικασίας σε ασθενείς με βρογχεκτασίες. Το βρογχοκυψεδικό έκπλυμα (BAL) ασθενών με βρογχεκτασίες περιέχει μεγαλύτερο αριθμό πολυμορφοπυρήνων σε σύγκριση με αυτά που μετρήθηκαν σε φυσιολογικά άτομα4. Ανάλογα ήταν τα αποτελέσματα και στην δική μας μελέτη χρησιμοποιώντας όμως μία μη επεμβατική μέθοδο όπως είναι η προκλητή απόχρεμψη. Ο υψηλός αριθμός πολυμορφοπυρήνων, η σημαντική συσχέτισή τους με τα μετρηθέντα επίπεδα H2O2 καθώς και η αρνητική συσχέτιση των μακροφάγων με τα επίπεδα H2O2, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι, στους ασθενείς με βρογχεκτασίες τα πολυμορφοπύρηνα αποτελούν την κύρια πηγή παραγωγής H2O2. Με δεδομένο δε ότι, με την μέθοδο ανίχνευσης της αμυλάσης και με το σύστημα συλλογής συμπυκνώματος εκπνεόμενου αέρα έχει αποκλειστεί η ανάμειξη του δείγματος με σίελο, που ως γνωστό, περιέχει υψηλά επίπεδα H2O2.

Στους ασθενείς με βρογχεκτασίες, κάποιοι δείκτες φλεγμονής σχετίζονται με την έκταση της νόσου ενώ άλλοι με τις λειτουργικές δοκιμασίες. Έχει βρεθεί ότι συστηματικοί δείκτες φλεγμονής που απομονώθηκαν από δείγματα ορού βρογχεκτασικών ασθενών σχετίζονται άμεσα με την βαρύτητα της απόφραξης όπως αυτή εκτιμάται με την σπιρομέτρηση5. Υπάρχει όμως η αμφισβήτηση κατά πόσον παράμετροι του ορού μπορεί να εκφράζουν την φλεγμονή που παρατηρείται στους αεραγωγούς ασθενών με βρογχεκτασίες. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι τα επίπεδα του H2O2 σχετίζονται με την FEV1 % αναμ. καθώς και με την έκταση της νόσου, όπως αυτή ορίσθηκε με την HRCT. Ανάλογες συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ FEV1 % αναμ., HRCT και επί τοις εκατό αριθμού πολυμορφοπυρήνων στην προκλητή απόχρεμψη. Η συσχέτιση μεταξύ έκτασης της νόσου και απόφραξης των αεραγωγών είναι ήδη γνωστή22. Επιπρόσθετα, ο αριθμός των πολυμορφοπυρήνων από το BAL σχετίζεται με το βαθμό απόφραξης των αεραγωγών όπως αυτή ορίσθηκε με την FEV1 % αναμ.4. Αυτές οι προηγούμενες παρατηρήσεις οδηγούσαν στο συμπέρασμα ότι η βαρύτητα της λειτουργικής απόφραξης εκφράζει ως ένα βαθμό την βαρύτητα της φλεγμονής των αεραγωγών καθώς και την έκταση της νόσου. Η παραπάνω θεωρία επιβεβαιώθηκε εν μέρει και από την δική μας μελέτη η οποία επιπρόσθετα έδειξε ότι υφίσταται μία ακόμα σημαντική συσχέτιση, αυτή της έκτασης της νόσου με την πολυμορφοπυρηνική φλεγμονή από την προκλητή απόχρεμψη. Η τελευταία αυτή παρατήρηση είναι η πρώτη που θεωρεί ότι η βαρύτητα της φλεγμονής σε ασθενείς με βρογχεκτασίες σχετίζεται άμεσα με την έκταση της νόσου. Αν λοιπόν λάβουμε υπ’ όψιν όλα τα παραπάνω, είναι προφανές ότι η φλεγμονή των αεραγωγών, η βαρύτητα της απόφραξης των αεραγωγών και η έκταση της νόσου αποτελούν σημαντικά στοιχεία για την αξιολόγηση ασθενών με βρογχεκτασίες. Η πρώιμη δε αξιολόγηση τους μπορεί να αποτελέσει σημαντικό στοιχείο για την μετέπειτα πορεία της νόσου3,5. Βασιζόμενοι στα αποτελέσματα αυτής της μελέτης θεωρούμε ότι η μέτρηση του H2O2 μπορεί να αποτελέσει σημαντικό βοήθημα στην αξιολόγηση και παρακολούθηση των παραμέτρων αυτών. Πρέπει να τονίσουμε όμως ότι οι λειτουργικές δοκιμασίες που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη αυτή δεν αποτελούν δείκτες της νόσου των μικρών αεραγωγών, ή της παρουσίας η όχι ινώσεως. Η μελέτη αυτών των ειδικών λειτουργικών δοκιμασιών θεωρείται σημαντική στην αξιολόγηση της λειτουργικής βαρύτητας της νόσου αλλά όχι στην παρακολούθησή της3.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι ασθενείς με άσθμα και σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας που ελάμβαναν στεροειδή, εισπνεόμενα η παρεντερικά αντίστοιχα, είχαν χαμηλότερες τιμές H2O2 στο συμπύκνωμα του εκπνεόμενου αέρα, σε σχέση με αυτούς που δεν ελάμβαναν στεροειδή23,24. Το σημαντικό μειονέκτημα των μελετών αυτών είναι ότι δεν σχεδιάστηκαν ως διπλές τυφλές μελέτες και έτσι δεν μπορούν να εξαχθούν σαφή συμπεράσματα για τον ρόλο των στεροειδών στις συγκεντρώσεις του H2O2. Σε μία πρόσφατη μελέτη με ανάλογο σχεδιασμό και σχετικά μικρό πληθυσμό μελέτης, η λήψη εισπνεόμενων στεροειδών συνδυάζετο με μειωμένη παρουσία Τ κυττάρων και IL-8 στο βρογχικό βλεννογόνο ασθενών με βρογχεκτασίες25. Σε ανάλογη μελέτη με σχεδιασμό διπλής-τυφλής, ασθενείς με βρογχεκτασίες που έλαβαν εισπνεόμενα στεροειδή παρουσίασαν μείωση του όγκου των πτυέλων και βελτίωση της σπιρομέτρησης26. Η δική μας μελέτη έδειξε ότι η λήψη στεροειδών δεν επηρέαζε θετικά καμμία παράμετρο απο αυτές που χρησιμοποιήθηκαν για αξιολόγηση. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνονται ως προς το H2O2 από προηγούμενες παρατηρήσεις όπου η χορήγηση μεθυλπρεδνιζολόνης δεν είχε καμμία επίδραση στην παραγωγή του27. Ανάλογα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για το CO6 αλλά όχι για το NO17, όπου ασθενείς που ελάμβαναν εισπνεόμενα στεροειδή είχαν χαμηλότερες τιμές εκπνεόμενου NO όταν συγκρίθηκαν με ασθενείς χωρίς λήψη εισπνεομένων στεροειδών. Η παραπάνω διαφορά μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι το ΝΟ προέρχεται απο κύτταρα πιο ευαίσθητα στα στεροειδή.

Συμπερασματικά, η μέτρηση του H2O2, σε συμπύκνωμα εκπνεόμενου αέρα, αποτελεί μία απλή και κυρίως μία μη επεμβατική μέθοδο για την αξιολόγηση και ίσως για την παρακολούθηση ασθενών με βρογχεκτασίες. Παραμένει όμως ως μεγάλο ερωτηματικό αλλά και ως πρόκληση για μελλοντικές μελέτες κατά πόσον η χορήγηση αντιοξειδωτικών ουσιών, μέσω της μείωσης των οξειδωτικών μορίων, προκαλεί την ανάλογη κλινική και λειτουργική βελτίωση της νόσου.

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Eller J, Lapa-e-Silva JR, Poulter LH, Lode H, Cole PJ. Cells and cytokines in chronic bronchial infection. Ann NY Acad Sci, 1994, 725: 331-345.
2. Barker AF, Bardana EJ. Bronchiectasis: Update of an orphan disease. Am Rev Respir Dis, 1988, 137: 969-978.
3. Hansell DM. Bronchiectasis. Rad Clinics North America, 1998, 36(1):107-128.
4. Sepper R, Konttinen YT, Ding Y, Takagi M, Sorsa T. Human neutrophil collagenase (MMP-8), identified in bronchiectasis BAL fluid, correlates with severity of disease. Chest, 1995, 107:1641-1647.
5. Wilson CB, Jones PW, O’Leary CJ, Hansell DM, Dowling RB, Cole PJ, Wilson R. Systemic markers of inflammation in stable bronchiectasis. Eur Respir J, 1998, 12: 820-824.
6. Horvath I, Loukides S, Wodehouse T, Kharitonov SA, Cole PJ, Barnes PJ. Increased levels of exhaled carbon monoxide in bronchiectasis. A new marker of oxidative stress. Thorax, 1998, 53: 867-870.
7. Pizzichini E, Pizzichini MMM, Efthimiadis A, Hargreave FE. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid phase measurements. Am J Respir Crit Care Med, 1996, 154: 308-317.
8. Pizzichini MMM, Pizzichini E, Clelland EL, Hargreave FE. Sputum in severe exacerbations of asthma: kinetics of inflammation indices after prednisone treatment. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155: 1501-1508.
9. Dohlman AW, Black HR, Royall JA. Expired breath hydrogen peroxide is a marker of acute airway inflammation in paediatric patients with asthma. Am Rev Respir Dis, 1993, 148: 955-960.
10. Baldiwn SR, Grum CM, Boxer LA, Simon RH, Ketai LH, Devall LJ. Oxidant activity in expired breath of patients with adult respiratory distress syndrome. Lancet, 1986, 1: 11-14.
11. Dekhuijzen RPN, Aben KKH, Dekker I, Aarts PHJ, Wielders PML, Van Herwaaden LA, Bast AALT. Increased exhalation of hydrogen peroxide in patients with stable and unstable chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med, 1996, 154: 813-816.
12. Loukides S., Horvath I, Wodehouse T, Cole PJ Barnes PJ. Elevated levels of expired breath hydrogen peroxide in bronchiectasis. Am J Respir Crit Care Med, 1998, 158: 991-994.
13. Gallati H, Pracht I. Horseradish peroxidase: kinetic studies and optimization of peroxidase activity determination using the substrates H2O2 and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine. J Clin Chem Clin Biochem, 1985, 23: 453-460.
14. Keatings VM, Jatakanon A, Worsdell M, Barnes PJ. Effect of inhaled and oral glucocorticosteroids on inflammatory indices in asthma and COPD. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155: 542-548.
15. Keatings VM, O’Connor BJ, Wright LG, Huston DP, Corrigan CJ, Barnes PJ. Late response to allergen is associated with increased concentrations on TNF-a and interleukin-5 in induced sputum. J Allergy Clin Immunol, 1997, 99: 693-698.
16. Jobsis Q, Raaatgeep HC, Schellekens SL, Hop WCJ, Hermans PWM, de Jongste JC. Hydrogen peroxide in exhaled air of healthy children: reference values. Eur Respir J, 1998, 12: 483-485.
17. Horvath I, Donnelly LE, Kiss A, Kharitonov SA, Lim S, Chung KF, Barnes PJ. Combined use of exhaled hydrogen peroxide and nitric oxide in monitoring asthma. Am J Respir Crit Care Med, 1998, 158: 1042-1046.
18. Kharitonov SA, Wells AU, O’Connor BJ, Cole PJ, Hansell DM, Logan-Sinclair RB, Barnes PJ. Elevated levels of exhaled nitric oxide in bronchiectasis. Am J Respir Crit Care Med, 1995, 151: 1889-1893.
19. Heffner JE, Repine JE. Pulmonary strategies of antioxidant defense. Am Rev Respir Dis, 1989, 143: 362-368.
20. Greening AP, Lowrie DB. Extracellular release of hydrogen peroxide by human alveolar macrophages: the relationship to cigarette smoking and lower respiratory tract infection. Cli Sci, 1983, 65: 661-664.
21. Hyslop PA, Sklar LA. A quantitative fluometric assay for the determination of oxidant production by polymorhonuclear leukocytes: its use in the simultaneous fluorimetric assay of cellular activation processes. Anal Biochem, 1984, 141: 280-286.
22. Wong-You-Cheong JJ, Leahy BC, Taylor PM, Church CE. Airways obstruction and bronchiectasis: correlation with duration of symptoms and extent of bronchiectasis on computed tomography. Clin Radiol, 1992, 45: 256-259.
23. Jobsis Q, RaatgeepHC, Hermans PWM, de Jongste JC. Hydrogen peroxide in exhaled air is increased in stable asthmatic children. Eur Respir J, 1997, 10: 519-521.
24. Sznajder JI, Fraiman A, Hall JB, Sanders W, Schmidt G, Crawford G, Nahum A, Factor P, Wood LDH. Increased hydrogen peroxide in the expired breath of patients with acute hypoxemic respiratory failure. Chest, 1989, 96: 606-612.
25. Gaga M, Bentley AM, Humbert M, Barkans J, O’ Brien F, Wathen CG, Kay AB, Durham SR. Increases in CD4+ T lympocytes, macrophages, neutrophils and interleukin 8 positive cells in the airways of patients with bronchiectasis. Thorax, 1998, 53: 685-691.
26. Elborn JS, Johnston B, Allen F, Clarke J, McGarry J, Varghese G. Inhaled steroids in patients with bronchiectasis. Respir Med, 1992, 86:121-124.
27. McLeish KR, Miller FN, Stelzer GT, Wellhausen SR. Mechanism by which methylprednisolone inhibits acute immune complex-induced changes in vascular permeability. Inflammation, 1986, 10: 321-332.

© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE