Please wait. Loading...
 
Αποστολή σε φίλο
 
Ενεργοποίηση κυψελιδικών μακροφάγων προστατεύει από νεοπλασία Μετσοβίτες εκτεθειμένους σε ίνες αμιάντου
ΠΕΡΙΛΗΨΗ: Οι κάτοικοι της περιοχής Μετσόβου έχουν εκτεθεί σε ίνες αμιάντου (τρεμολίτη), από χρήση του “λούτου” (ασπρόχωμα), για το άσπρισμα των εσωτερικών χώρων. Η κύρια έκφραση της απάντησης του πνεύμονα των ατόμων αυτών στην εισπνοή ινών αμιάντου, ήταν αυξημένη επίπτωση σε κακοήθες μεσοθηλίωμα και υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις. Όμως οι μελέτες μας έδειξαν ότι οι Μετσοβίτες με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις έχουν μικρότερη επίπτωση μεσοθηλιώματος, ενώ στη βρογχοκυψελιδική έκπλυση εμφανίζουν λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα. Γι αυτό θεωρήσαμε ότι ίσως η λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα αποτελεί ένδειξη “προστασίας” έναντι νεοπλασίας. Στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε την υγρά φάση της βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης με σκοπό να ανιχνεύσουμε τυχόν παράγοντες και προϊόντα κυττάρων που θα μπορούσαν να θεωρηθούν υπεύθυνα αυτής της “προστασίας”. Εξετάσαμε 43 Μετσοβίτες, 13 με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις και 30 χωρίς. Ανάμεσα στις δύο ομάδες υπήρχε μια σημαντική διαφορά. Οι Μετσοβίτες με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις εμφάνιζαν δύο επιπλέον πρωτεΐνες, οι οποίες δεν υπήρχαν σε κανένα άτομο χωρίς αποτιτανώσεις αλλά και σε κανένα άτομο των ομάδων ελέγχου. Για την αναγνώριση των επιπλέον πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε πρόγραμμα ηλεκτρονικού υπολογιστή (Melanie II 2-D PAGE). Συγκρινόμενες αυτές με πρότυπες εικόνες ηλεκτροφορητικών διαγραμμάτων ανθρωπίνου πλάσματος, φαίνεται ότι εντοπίζονται στις περιοχές όπου ανιχνεύονται: α) Η βαρειά αλυσίδα ανοσοσφαιρίνης και β) ο C4, παράγοντας του συμπληρώματος. Και οι δύο μπορούν να αποδοθούν σε ενεργοποιημένα κυψελιδικά μακροφάγα. Είναι γνωστό ότι τα κυψελιδικά μακροφάγα που αποσυντίθενται από ίνες αμιάντου παράγουν πρωτεολυτικά ένζυμα, ενώ χρονίως ανοσοδιεγερμένα κυψελιδικά μακροφάγα, προκαλούν αύξηση των IgG, C3 και C4. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι υπάρχουν δύο ξεχωριστές ομάδες Μετσοβιτών. Στην πρώτη. τα κυψελιδικά μακροφάγα είναι εντόνως ενεργοποιημένα. Τα άτομα αυτής της ομάδας εμφανίζουν υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις, λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα, τις επιπλέον πρωτεΐνες και “προστασία” έναντι της νεοπλασίας. Στην δεύτερη ομάδα, τα κυψελιδικά μακροφάγα είναι μετρίως ενεργοποιημένα. Τα άτομα αυτής της ομάδας δεν εμφανίζουν υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις ούτε λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα αλλά ούτε και τις επιπλέον πρωτεΐνες ενώ δεν εμφανίζουν ούτε “προστασία” έναντι νεοπλασίας. Πνεύμων 2000, 13 (1): 14-22

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Οι κάτοικοι της περιοχής Μετσόβου (πληθυσμός 5.000) έχουν εκτεθεί από παιδική ηλικία σε ίνες αμιάντου και συγκεκριμένα, τρεμολίτη1. Το αποτέλεσμα της έκθεσης αυτής ήταν η εμφάνιση υπεζωκοτικών αποτιτανώσεων (47% του πληθυσμού)2,3 και η αυξημένη επίπτωση σε κακοήθες μεσοθηλίωμα (300 φορές υψηλότερη από ότι στο γενικό πληθυσμό)4. Το ενδιαφέρον όμως ήταν ότι κακοήθες μεσοθηλίωμα εμφάνιζαν πολύ πιο συχνά οι Μετσοβίτες χωρίς υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις5,6. Στην επόμενη φάση της μελέτης η βρογχοκυψελιδική έκπλυση απεκάλυψε λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα, μόνο στα άτομα που εμφάνιζαν υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις και προτάθηκε ότι η λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα και οι υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις αποτελούν "προστασία" έναντι της νεοπλασίας6.

Σε προηγούμενες μελέτες αναλύσαμε τα κύτταρα της βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης. Στην παρούσα μελέτη αναλύουμε την υγρά φάση και τα προϊόντα των φλεγμονωδών και ανοσοδραστικών κυττάρων της βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης των Μετσοβιτών. Από τα μέχρι τώρα στοιχεία φαίνεται ότι δεν αντιδρούν όλα τα άτομα με τον ίδιο τρόπο στην έκθεση σε αμίαντο. Ο σκοπός λοιπόν αυτής της μελέτης είναι να διερευνήσει ακριβώς αυτή τη διαφοροποίηση.

 

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Πληθυσμός μελέτης

Μελετήθηκαν: α) Δεκατρείς Μετσοβίτες με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις (εικόνα 1) και β) 30 Μετσοβίτες χωρίς υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις. Από τους τελευταίους, οι 5 είχαν κακοήθες μεσοθηλίωμα του υπεζωκότα και οι 5 βρογχογενές καρκίνωμα. Ως ομάδες ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν: α) Πέντε ασθενείς με πρωτοπαθές σύνδρομο Sjφgren και έντονη λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα7 και β) Πέντε ασθενείς, όχι Μετσοβίτες, με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις από άλλες αιτίες, όπως φυματίωση κ.λ.π. Οι δύο ομάδες ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν, ώστε να αποκλεισθεί η πιθανότητα οι τυχόν παρατηρήσεις μας στους Μετσοβίτες να οφείλονται στην λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα ή στις υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις και όχι στην εισπνοή ινών αμιάντου.

Βρογχοσκόπηση και βρογχοκυψελιδική έκπλυση

Η βρογχοσκόπηση και η βρογχοκυψελιδική έκπλυση έγιναν όπως έχουμε ήδη περιγράψει αλλού6.

Image 1
Εικόνα 1. Απλή ακτινογραφία θώρακα σε ένα Μετσοβίτη με εκτεταμένες υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις.

 

Ανάλυση της υγράς φάσης

Πρωτεΐνες

Ο προσδιορισμός της ολικής ποσότητας των πρωτεϊνών έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο Lowry8. Αλβουμίνη IgG και IgA προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο της απλής ακτινωτής ανοσοδιάχυσης. Οι IL6, IL2 και IL7 προσδιορίστηκαν με την ανοσοενζυμική τεχνική ELISA.

Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS

Η ηλεκτροφόρηση SDS πολυακρυλαμιδίου έγινε ακολουθώντας το πρωτόκολλο του Laemmli9. Για τη δημιουργία της πηκτής διαχωρισμού (SDS - 10% πολυακρυλαμίδιο) αναμίχθηκαν 41,7 ml H2O, 1,5 M Tris - 0,4% w/v SDS, pH 8,8 και 33,3 ml διαλύματος 29,2% w/v ακρυλαμιδίου - 0,8% w/v δις-ακρυλαμιδίου. Ο πολυμερισμός έγινε με 10% υπερθειϊκού αμμωνίου και 0,05 ml TEMED. Στην συνέχεια πάνω στην πηκτή διαχωρισμού τοποθετήθηκε η πηκτή συσσώρευσης, η οποία παρασκευάστηκε με την ανάμειξη 18ml H2O, 0,5 M Tris- 0,4% w/v SDS, pH 6,8, 4,5 ml διαλύματος 29,2% w/v ακρυλαμιδίου - 0,8% w/v δις-ακρυλαμιδίου, 0,3 ml διαλύματος 10% υπερθειικού αμμωνίου και 0,03 ml TEMED. Τα πρωτεϊνικά δείγματα θερμάνθηκαν επί 3 λεπτά στους 100°C.

Αναλυτικός ισοηλεκτρικός εστιασμός και ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων

α) Πρώτη διάσταση - Ισοηλεκτρικός εστιασμός

Ο εστιασμός γίνεται σε γυάλινους σωλήνες ύψους 12 cm και εσωτερικής διαμέτρου 2mm, όπου πολυμερίζεται η πηκτή εστιασμού μέχρις ύψους 8 mm. Το διάλυμα πηκτής εστιασμού παρασκευάζεται με τη διάλυση 5,5gr ουρίας σε 1,330ml διαλύματος 28,38% w/v ακρυλαμιδίου - 1,62% w/v δις-ακρυλαμιδίου, 2ml διαλύματος 10% ml v/v NP-40 και 1,970 ml H2O. Στο μίγμα προστίθενται 0,9 ml αμφολύτες ευρέως φάσματος (Pharmacia, Sigma), 10μl πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος 10% w/v υπερθειϊκού αμμωνίου και 7μl TEMED. Το μίγμα τοποθετείται προσεκτικά και με τη βοήθεια σιφωνίου Pasteur στους σωλήνες που έχουν σφραγισθεί με parafilm, προστίθεται ddH2O στον εναπομείναντα χώρο και η πηκτή αφήνεται να πολυμερισθεί για 2 ώρες τουλάχιστον. Τα σωληνάκια τοποθετούνται στη συσκευή εστιασμού (Hoefer) και σε κάθε σωλήνα τοποθετούνται 10μl διαλύματος αποδιάταξης (9,5 Μ ουρία, 2% v/v NP-40, 2% v/v αμφολύτες και 5% v/v β-μερκαπτοαιθανόλη) και 10μl διαλύματος υπερχείλισης (6Μ ουρία, 2% v/v NP-40, 1%v/v αμφολύτες και 5% v/v β-μερκαπτοαιθανόλη). Η κάτω δεξαμενή της συσκευής εστιασμού πληρούται με διάλυμα 0,01 Μ φωσφορικού οξέος και η πάνω δεξαμενή με διάλυμα 0,02 Μ υδροξειδίου του νατρίου και γίνεται εξισορρόπηση των πηκτών με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου τάσης 200 V για 15 λεπτά, 300 V για 30 λεπτά και 400 V για 60 λεπτά. Μετά το τέλος της εξισορρόπησης στην κορυφή κάθε πηκτής - ράβδου τοποθετείται το πρωτεϊνικό δείγμα, το οποίο έχει επωασθεί για 10 λεπτά με διάλυμα αποδιάταξης, καθώς και 10μl διαλύματος υπερχείλισης. Οι δεξαμενές πληρούνται με νέα διαλύματα ανόδου - καθόδου και ακολουθεί ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων στα 400 V για 18 ώρες. Η πηκτή απομακρύνεται προσεκτικά από το σωληνάκι και τοποθετείται οριζόντια πάνω από την πηκτή της δεύτερης διάστασης10.

β) Δεύτερη διάσταση - Πηκτή SDS πολυακρυλαμιδίου

Η πηκτή του εστιασμού εξισορροπείται για 20 λεπτά με 1ml διαλύματος διαλυτοποίησης. Η ακόλουθη διαδικασία είναι ίδια όπως περιγράφηκε προηγουμένως για την ηλεκτροφόρηση πηκτής SDS- πολυακρυλαμιδίου

γ) Καθορισμός της βαθμίδωσης του pΗ

Η πηκτή του εστιασμού της πρώτης διάστασης κόβεται σε μικρά κομμάτια, 1cm το καθένα τα οποία τοποθετούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν 2ml ddΗ2Ο ο καθένας. Οι σωλήνες αναδεύονται ισχυρά και μετά από 12 ώρες μετριέται το pΗ.

Η ποσότητα πρωτεΐνης που ηλεκτροφορήθηκε σε κάθε πείραμα ήταν πάντοτε σταθερή και ίση με 150μg/ml.

Σε πειράματα στα οποία η πηκτή χρώστηκε, χρησιμοποιήθηκε η χρώση , σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφτηκε από τον Blum H. et al11.

Τις πρωτεΐνες τις αναγνωρίζουμε με πρόγραμμα ηλεκτρονικού υπολογιστή (Melanie II 2-D ΡAGE)12.

 

Εφαρμογή προγράμματος ηλεκτρονικού υπολογιστή για χαρακτηρισμό των πρωτεϊνικών κηλίδων

Το Melanie II 2-D PAGE, είναι μια ολοκληρωμένη προγραμματιστική εφαρμογή που δημιουργήθηκε με σκοπό να αναλύει εικόνες από ηλεκτροφορήσεις δύο διαστάσεων, μπορεί δε να εκτελεί ποιοτική και ποσοτική ανάλυση.

Πάνω στην υπό μελέτη εικόνα, σημειώνονται οι περιοχές των οποίων γνωρίζουμε τις συντεταγμένες και το όνομα. Οι συντεταγμένες αναφέρονται σε τιμές pl και MW. Οι γνωστές τιμές, διευκολύνουν στην αναγνώριση οποιασδήποτε συντεταγμένης (δηλ.pl και MW) στην εικόνα. Τα γνωστά σημεία που προαναφέρθησαν, χρησιμοποιούνται από το πρόγραμμα για την "ευθυγράμμιση" της εικόνας ως προς την πρότυπη εικόνα αναφοράς και τον χαρακτηρισμό κάθε σημείου. Δηλαδή γίνεται εξομοίωση της εικόνας με την πρότυπη, με σημεία αναφοράς τις γνωστές πρωτεΐνες που βρίσκονται και στις δύο εικόνες.

Με τη χρήση αλγορίθμων, τα άγνωστα κηλιδικά σημεία της άγνωστης εικόνας, ταυτίζονται, εάν, στις συγκεκριμένες θέσεις του προτύπου, υπάρχουν ήδη αναγνωρισμένες πρωτεΐνες.

Ως εικόνες αναφοράς, χρησιμοποιούμε πρότυπες εικόνες ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων από ανθρώπινο πλάσμα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αναγνώριση των εμφανιζόμενων κηλίδων στην υπό μελέτη εικόνα, αφού στην πρότυπη δίνονται πληροφορίες για την πρωτεΐνη και τις τιμές pl και MW, για την κηλίδα που μας ενδιαφέρει.

Πρέπει ωστόσο να σημειωθεί, ότι η εξομοίωση των εικόνων, βασίζεται σε μια σειρά μαθηματικών σχέσεων, που περιλαμβάνουν τιμές pl και MW, γι αυτό και θα πρέπει στην υπό μελέτη εικόνα να αναγνωρισθούν εξαρχής τρία τουλάχιστον pl και MW, ώστε να γίνει εφικτή η παραπέρα διαδικασία.

Στατιστική Ανάλυση:

Η στατιστική ανάλυση που χρησιμοποιήσαμε ήταν το Students' t test για να μελετήσουμε την πιθανή σχέση μεταξύ δύο παραμέτρων. Η τιμή p<0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

 

 

Table 1

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

1. Ολικό ποσό πρωτεϊνών

Στους Μετσοβίτες με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις ανιχνεύουμε μεγαλύτερο ποσό ολικής πρωτεΐνης στο υγρό της βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης από ότι στους Μετσοβίτες χωρίς αποτιτανώσεις, αλλά χαμηλότερο από ότι στους ασθενείς με πρωτοπαθές σύνδρομο
Sjφgren (114,5±35,5 έναντι 71,0±53.9 έναντι 26,2±51,8 μg/ml, p<0,01 και p<0,001 αντιστοίχως) (πίνακας 1).

2. Προσδιορισμός Αλβουμίνης και ανοσοσφαιρινών IgG, IgA

Και στις δύο ομάδες Μετσοβιτών τα ποσά της Αλβουμίνης και των IgG, IgA δεν διαφέρουν σημαντικά. Στους ασθενείς με πρωτοπαθές σύνδρομο Sjφgren τα ποσά τους είναι πολύ υψηλότερα από ότι στις δύο ομάδες Μετσοβιτών.

3. Προσδιορισμός IL-6, IL-7και IL-2

Στους Μετσοβίτες με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις ανιχνεύουμε χαμηλότερο ποσό IL-6 στο υγρό της βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης από ότι στους Μετσοβίτες χωρίς αποτιτανώσεις, αλλά και στις δύο ομάδες το ποσό της IL-6 είναι χαμηλότερο από ότι στους ασθενείς με πρωτοπαθές σύνδρομο Sjφgren (17,9±11,6 έναντι 24,5±8,5 έναντι 29,2±6,9pg/ml, p=0,203, p=0,054 και p=0,263 αντιστοίχως) (πίνακας 1).

 

Image 2
Εικόνα 2. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών με SDS υγρού βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης Μετσοβιτών με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις (α) και χωρίς υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις (β).

 

 

4. Ανάλυση πρωτεϊνών με SDS

Ανάμεσα στις δύο ομάδες Μετσοβιτών, η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών από βρογχοκυψελιδική έκπλυση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (S.D.S) δεν είχε διαφορές (εικ. 2). Και στις δύο ομάδες ανιχνεύεται η Αλβουμίνη με μοριακό βάρος 67ΚDa, σε μεγαλύτερο ποσοστό, ακολουθούν οι ανοσοσφαιρίνες IgG με Μ.Β. 150ΚDa και η IgA με Μ.Β. 180ΚDa. Μετά ακολουθούν οι πρωτεΐνες τρανσφερίνη με Μ.Β. 80ΚDa και η α1-αντιθρυψίνη με Μ.Β. 50ΚDa. Οι ασθενείς με πρωτοπαθές σύνδρομο Sjφgren είχαν παρόμοιες πρωτεΐνες στα υγρά της βρογχοκυψελιδικής έκπλυσής τους.

5. Ανάλυση πρωτεϊνών ηλεκτροφόρηση με δύο διαστάσεων

Η ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων απεκάλυψε επιπλέον πρωτεΐνες στο υγρό βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης όλων των Μετσοβιτών με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις (εικ. 3α).

Συγκεκριμένα εντοπίσθηκαν 2 πρωτεϊνικές κηλίδες:

Η πρώτη με μοριακό βάρος περίπου 55 και με pl 7- 7.5 και η δεύτερη με μοριακό βάρος περίπου 34 και με pl 6.2.

Οι πρωτεΐνες αυτές απουσίαζαν τελείως από όλους τους Μετσοβίτες χωρίς αποτιτανώσεις, όπως και από τις ομάδες ελέγχου (εικ. 3β). Οι πρωτεΐνες αυτές δεν ήταν εμφανείς στην ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS).

 

Image 3
Εικόνα 3. Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων πρωτεϊνών υγρού βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης Μετσοβίτη με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις (α) και χωρίς υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις (β).
ΙΑ = Ανοσοσφαιρίνη Α, ΙG=Ανοσοσφαιρίνη G, Τ = Τρανσφερίνη, Α = Αλβουμίνη, α1 = α1Αντιθρυψίνη. Οι επιπλέον πρωτεϊνικές κηλίδες σημειώνονται με Χ και Υ και αυτές εμφανίζονται μόνο στους Μετσοβίτες με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις (εικόνα 3α).

 

 

6. Αναγνώριση των επιπλέον πρωτεϊνικών κηλίδων με πρόγραμμα ηλεκτρονικού υπολογιστή

Στα άτομα από το Μέτσοβο με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις και με έντονη λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα, ανιχνεύθησαν επιπλέον πρωτεϊνικές κηλίδες με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων.

Συγκρινόμενες αυτές με πρότυπες εικόνες ηλεκτροφορητικών διαγραμμάτων ανθρωπίνου πλάσματος (Melanie II 2-D Page), φαίνεται ότι εντοπίζονται στις περιοχές όπου ανιχνεύονται οι κάτωθι πρωτεΐνες:

α) Βαρειά αλυσίδα ανοσοσφαιρίνης, (Μ.Β.= 55ΚDa, pl=7-7.5).

β) C4, παράγων του συμπληρώματος (Μ.Β.= 34ΚDa, pl=6.2).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Οι μελέτες μας6 έδειξαν ότι οι Μετσοβίτες που έχουν εκτεθεί σε ίνες αμιάντου από παιδικής ηλικίας, διαφοροποιούνται σε δύο ξεχωριστές ομάδες. Η πρώτη ομάδα αντιδρά εντόνως στην εισπνοή ινών αμιά ντου. Τα άτομα της πρώτης ομάδας εμφάνιζαν υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις και Τ-λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα. Η δεύτερη ομάδα δεν εμφάνιζε υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις, αλλά ούτε λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα. Η τελευταία αυτή ομάδα περιλάμβανε όμως και την πλειοψηφία των μεσοθηλιωμάτων που διεγνώσθησαν. Το συμπέρασμα της μελέτης ήταν ότι, η εμφάνιση των υπεζωκοτικών αποτιτανώσεων και της λεμφοκυτταρικής κυψελιδίτιδας στα άτομα της πρώτης ομάδας, όπου πρακτικά δεν περιλαμβάνονται μεσοθηλιώματα, πιθανότατα αποτελεί κομμάτι ενός προστατευτικού μηχανισμού του πνεύμονα, έναντι των ινών αμιάντου6.

Η υπόθεσή μας είναι ότι, το κακοήθες μεσοθηλίωμα και οι υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις είναι δύο διαφορετικές απαντήσεις στην εισπνοή ινών αμιάντου, στον πληθυσμό του Μετσόβου. Αφού δε στην ομάδα με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις παρατηρούνται αυξημένα ποσοστά λεμφοκυττάρων στη βρογχοκυψελιδική τους έκπλυση, υποθέτουμε το ενδεχόμενο η συνδυασμένη αυτή αντίδραση να παίζει κάποιο ρόλο στην προστασία των ατόμων αυτών έναντι της νεοπλασίας. Θεωρούμε ότι τα αποτελέσματα της παρούσης μελέτης υποστηρίζουν την υπόθεσή μας.

Χρησιμοποιήσαμε ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων για ανίχνευση πρωτεϊνών που υπάρχουν έστω και σε πολύ μικρές ποσότητες στη βρογχοκυψελιδική έκπλυση. Η ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων είναι η μέθοδος που δίνει τα πλέον αναλυτικά αποτελέσματα. Το πρόβλημα είναι η τεράστια ποσότητα δεδομένων που είναι δύσκολο να αναλυθούν και να αξιολογηθούν. Προς αυτή την κατεύθυνση βοήθησε η νέα τεχνολογία με προγράμματα Ηλεκτρονικού Υπολογιστή, όπου αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων συγκρίνονται με πρότυπα ηλεκτροφορητικά διαγράμματα.

Αν και η μέθοδος αυτή δεν είναι τόσο νέα, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με πρωτεΐνες ανιχνευόμενες με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων σε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με διάφορα πνευμονικά νοσήματα.

Το 1993 οι Lenz et al13, την χρησιμοποίησαν για να χαρτογραφήσουν πρωτεΐνες, ακόμη και σε πολύ μικρές ποσότητες, σε βρογχοκυψελιδική έκπλυση υγιών εθελοντών, καθώς και ασθενών με σαρκοείδωση, ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση και αμιάντωση. Η τυπική ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων σε υγιείς έδειξε 50% λευκωματίνες, 5.5% τρανσφερίνη, 3.6% α1-αντιθρυψίνη και 30% ανοσοσφαιρίνες (IgA και IgG). Στη σαρκοείδωση ευρέθη αύξηση IgA και IgG καθώς και διεσπαρμένη α1-αντιθρυψίνη. Τέτοια πολυπεπτίδια - πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους βρέθηκαν στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση και σε ασθενείς με αμιάντωση και απεδόθησαν σε δράση πρωτεολυτικών ενζύμων ενεργοποιημένων μακροφάγων. Τέλος, σε 19 στους 25 ασθενείς με σαρκοείδωση ανιχνεύτηκε μια άγνωστη πρωτεΐνη (pl 4.5 και Μ.Β. 12ΚDa) που δεν ανιχνεύτηκε σε καμμία άλλη νόσο και πιθανολογείται ότι είναι ειδική για τη σαρκοείδωση.

Λίγα χρόνια αργότερα οι Lindhall et al14, αξιολόγησαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων την υγρά φάση βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης υγιών καπνιστών και μη καπνιστών και τη συνέκριναν με άτομα εκτεθέντα στον αμίαντο. Το πλέον σημαντικό σημείο της εργασίας αυτής είναι ότι όπως και στη δική μας μελέτη, ένας αριθμός ασθενών εκτεθέντων στον αμίαντο εμφανίζει δύο πλέον πρωτεΐνες, με Μ.Β. 88ΚDa και 64ΚDa . Προσπάθεια για ταυτοποίηση των πρωτεϊνών αυτών δεν έγινε. Η πρώτη (88ΚDa) εμφανίζεται σε 4 από 5 ασθενείς με μαζική ασβεστοποιό παχυπλευρίτιδα (οντότητα πάντως που δεν είναι χαρακτηριστική εκθέσεως στον αμίαντο) και σε έναν ασθενή με αυξανόμενες στο χρόνο υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις, ενώ δεν εμφανίζεται σε κανέναν άλλο ασθενή με απλές υπεζωκοτικές πλάκες. Η δεύτερη επιπλέον πρωτεΐνη (64ΚDa) εμφανίζεται στους δύο ασθενείς με προοδευτικά επιδεινούμενη νόσο (ένας με υπεζωκοτικές πλάκες και ένας με ασβεστοποιό παχυπλευρίτιδα).

Ανάμεσα στην τελευταία αυτή εργασία14 και τη δική μας υπάρχουν ενδιαφέρουσες ομοιότητες και διαφορές. Η βασική ομοιότητα είναι η ανίχνευση, και στις δύο, επιπλέον κηλίδων και μάλιστα δύο. Στη μελέτη των Lindhall et al14 ανιχνεύονται δύο πρωτεΐνες με Μ.Β. 64ΚDa και 88ΚDa (σε διαφορετικές ομάδες εκτεθέντων). Στη δική μας μελέτη ανιχνεύονται δύο πρωτεΐνες με Μ.Β. 55ΚDa και 34ΚDa στους Μετσοβίτες με κυψελιδίτιδα και υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις. Όμως σε κανέναν από τους ελάχιστους Μετσοβίτες με κυψελιδίτιδα χωρίς αποτιτανώσεις δεν ανιχνεύτηκαν οι πρωτεΐνες αυτές. Ισως δηλαδή προϋπόθεση είναι οι αποτιτανώσεις κατ'αρχήν και όχι η κυψελιδίτιδα. Οι πρωτεϊνικές αυτές κηλίδες με Μ.Β. 55ΚDa και pl = 7-7.5 η πρώτη, με Μ.Β. 34ΚDa και pl = 6.2 η δεύτερη, συγκρινόμενες με πρότυπες εικόνες ηλεκτροφορητικών διαγραμμάτων ανθρωπίνου πλάσματος σε πρόγραμμα Ηλεκτρονικού Υπολογιστή (Melanie II 2-D PAGE) , φαίνεται ότι εντοπίζονται στις περιοχές όπου ανιχνεύονται οι κάτωθι πρωτεΐνες:

α) Βαρειά αλυσίδα ανοσοσφαιρίνης, (Μ.Β. = 55ΚDa, pl = 7-7.5).

β) C4, παράγων του συμπληρώματος (Μ.Β. = 34ΚDa, pl = 6.2).

Και οι δύο μπορούν να αποδοθούν σε ενεργοποιημένα κυψελιδικά μακροφάγα. Είναι γνωστό ότι κυψελιδικά μακροφάγα που αποσυντίθενται από ίνες αμιάντου παράγουν πρωτεολυτικά ένζυμα. Στη δράση τέτοιων ενζύμων αποδίδει η Lenz13 την ύπαρξη μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών μικρού μοριακού βάρους, στην αμιάντωση και άλλες καταστάσεις όπως ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση. Στη δράση τέτοιων ενζύμων μπορούμε και εμείς να αποδώσουμε την ύπαρξη βαρέων αλυσίδων ανοσοσφαιρινών.

Χρονίως ανοσοδιεγερμένα κυψελιδικά μακροφάγα όπως αυτά των καπνιστών, εδείχθη, με μελέτη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος, ότι προκαλούν μεταξύ άλλων και αύξηση C3 και C415. Η εισπνοή όμως ινών αμιάντου που εγκαθίστανται στον πνεύμονα, είναι βεβαίως μια άλλη σημαντική συνθήκη χρόνιας ανοσοδιέγερσης. Σ'αυτή μπορούμε να αποδώσουμε την έκλυση του C4, παράγοντος του συμπληρώματος, που αποτελεί ένα από τα κύρια προϊόντα τα οποία εκλύονται από ενεργοποιημένα μακροφάγα.

Συνεπώς τα αποτελέσματά μας (συνεπικουρούμενα από παρατήρηση άλλων ερευνητών, όπως αναφέρθησαν) τείνουν να υποδείξουν ότι ένα ποσοστό Μετσοβιτών αντιδρούν στην εισπνοή ινών αμιάντου με κυψελιδίτιδα και αποτιτανώσεις υπεζωκότα. Στα άτομα αυτά τα κυψελιδικά μακροφάγα εκκρίνουν, μεταξύ άλλων, πρωτεολυτικά ένζυμα που διασπούν ανοσοσφαιρίνες και παράγοντες συμπληρώματος (C4). Η διαφορά στις δύο ομάδες Μετσοβιτών έγκειται σε διαφορά βαθμού (ή διαφορά τύπου) ενεργοποίησης των κυψελιδικών μακροφάγων.

Θεωρούμε επομένως ότι η παρουσία των πρωτεϊνών αυτών στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα μόνο των Μετσοβιτών με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις, πιθανόν να αποτελεί το τρίτο στοιχείο ενός μηχανισμού ενεργοποίησης μακροφάγων, ο οποίος παρέχει προστασία έναντι της ανάπτυξης νεοπλασίας σε άτομα που έχουν έρθει σε επαφή με τον αμίαντο και συγκεκριμένα με:

1. Αυξημένο αριθμό λεμφοκυττάρων μεταξύ των οποίων και φυσικών φονικών κυττάρων, 2. υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις και 3. υπεράριθμες πρωτεΐνες στο υγρό βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης.

Η υπόθεσή μας ότι τα άτομα με αποτιτανώσεις ακολουθούν διαφορετική οδό ενεργοποίησης των αμυντικών μηχανισμών του πνεύμονα, σε σχέση με αυτούς χωρίς υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις, ενισχύεται και από άλλα στοιχεία που προέκυψαν.

Συγκεκριμένα, οι Μετσοβίτες με αποτιτανώσεις έχουν υψηλότερο ποσό ολικής πρωτεΐνης, αλβουμίνης και IgG σε σχέση με αυτούς χωρίς αποτιτανώσεις ενώ αντίθετα, εμφανίζουν μικρότερο ποσό IL-6. Η ιντερλευκίνη αυτή φαίνεται ότι ευοδώνει την ανάπτυξη νεοπλασίας16,17.

Πιστεύουμε λοιπόν ότι ο αυξημένος αριθμός λεμφοκυττάρων, τα μειωμένα επίπεδα IL-6 και η εμφάνιση επιπλέον πρωτεϊνών στους Μετσοβίτες με υπεζωκοτικές αποτιτανώσεις, αποτελούν στοιχεία κάποιου μηχανισμού "προστασίας" των έναντι νεοπλασίας. Το γεγονός ότι τα άτομα που παρουσίασαν κακοήθες μεσοθηλίωμα δεν εμφάνιζαν κανένα από τα παραπάνω χαρακτηριστικά στο βρογχοκυψελιδικό τους έκπλυμα, μας οδηγεί στη σκέψη ότι στα άτομα αυτά οι μηχανισμοί προστασίας δεν ενεργοποιήθηκαν ή δεν λειτούργησαν σωστά. Κύτταρο κλειδί σ' αυτή την ενεργοποίηση είναι το κυψελιδικό μακροφάγο.

Πιο λεπτομερείς και ειδικές μελέτες ενεργοποίησης κυψελιδικών μακροφάγων, είναι συνεπώς η υποχρεωτική συνέχεια της μελέτης αυτής.

 

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

1. Langer AM, Nolan RP, Constantopoulos SH, Moutsopoulos HM. Association of Metsovo lung and pleural mesothelioma with exposure to tremolite-containing whitewash. Lancet 1987; 1:965-7.

2. Bazas T, Bazas B, Kitas D, Gilson JC, McDonald JC. Pleural calcification in northwest Greece. Lancet 1981; 1:254.

3. Constantopoulos SH, Goudevenos JA, Saratzis N, Langer AE, Selikoff IJ, Moutsopoulos HM. Metsovo lung: pleural calcifications and restrictive lung function in North-West Greece: environmental exposure to mineral fiber as etiology. Environ. Res. 1985; 38:319-31.

4. Constantopoulos SH, Malamou-Mitsi V, Goudevenos J, Papathanasiou MP, Pavlidis NA, Papadimitriou CS. High incidence of malignant pleural mesothelioma in neighbouring villages of Northwest Greece. Respiration 1987; 51:266-71.

5. Constantopoulos SH, Saratzis NA, Kontogiannis D, Karantanas A, Goudevenos JA, Katsiotis P. Tremolite whitewash and pleural calcifications. Chest 1987; 92:709-712.

6. Constantopoulos SH, Dalavanga YA, Sakellariou K, Goudevenos J, Kotoulas OB. Lymphocytic alveolitis and pleural calcifications in non-occupational asbestos exposure: Protection against neoplasia? Am Rev Respir Dis 1992; 146:1363-1370.

7. Dalavanga YA, Constantopoulos SH, Galanopoulou V, Zerva L, Moutsopoulos HM. Alveolitis correlates with clinical pulmonary involvement in primary Sjφgren's syndrome. Chest 1991; 99:1394-1397.

8. Lowry O, Rosebrough NJ, Lewis FA, Randall RJ. Protein measurement with folin
© 2011 PNEUMON Magazine, Hellenic Bronchologic Society.
Developed by LogicONE Logo LogicONE